Optimización del diagnóstico, caracterización molecular y análisis de virulencia del virus de la septicemia hemorrágica viral (vhsv)

Resumo

El virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) es un patógeno de reconocido interés en el cultivo de trucha arcoiris (Onchorrhynchus mykiss). El único método de diagnóstico de VHVS reconocido oficialmente por la Unión Europea está basado en la detección del agente viral en cultivo celular seguido de la identificación mediante técnicas inmunológicas. En esta tesis se propone la RT-PCR como método de detección e identificación alternativo o complementario al cultivo celular. Para ello, se ha llevado a cabo la optimización de la técnica en todos sus pasos, incluyendo la extracción del ácido nucleico y la selección de cebadores. Los resultados obtenidos permitieron concluir que se ha conseguido poner a punto una metodología rápida, sensible (límite de detección 10 fg de ARN viral) y altamente específica para el diagnóstico de este virus. La sensibilidad del ensayo in vitro se ha testado usando RNA procedente de tejidos infectados experimentalmente. El límite de detección de la RT-PCR fue estimado en 1×10exp0 o 0,97×10exp3 TCID50/g (dependiendo de si la adsorción viral ha tenido lugar durante 1 o 24 horas, respectivamente). La confirmación de los resultados de RT-PCR, tanto mediante Southern blot como por nested-PCR, incrementaron la sensibilidad de la técnica de detección en 1 o 2 logaritmos, respectivamente. También, se ha desarrollado un método incruento para la detección del virus VHSV basado en la tecnología de la PCR, llevando a cabo experimentos in vivo que demostraron la superioridad, en términos de sensibilidad, del nested-PCR aplicado a muestras de sangre, ya que se obtuvo un 85% de positivos frente al 40% obtenido mediante RT-PCR y Southern blot y frente al 5% de positivos obtenidos mediante aislamiento en cultivo celular. Por otro lado, se evaluó la diversidad genética de un grupo de 32 aislados de VHSV con distinto origen, tanto geográfico como de hospedador, y se compararon con los genotipos representativos de