Purificación y caracterización de una isoforma de proteína quinasa C de manto de Mytilus galloprovincialis Lmk

Resumo

Las proteínas quinasas a través de la fosforilacion de sustratos regulan las respuestas fisiológicas celulares tanto a nivel citosolico como nuclear. Las diferentes isoformas de proteína quinasa C han sido caracterizadas en mamíferos y clasificadas en 3 grupos: las clásicas (cPKC) que son dependientes de DAG, Ca2+ y fosfatidil L-serina, las nueva (nPKC) que son dependientes de DAG y PL, e independientes de Ca2+, y las atípicas (aPKC) que solo son dependientes de PS. Las cPKC y las nPKC son sensibles a esteres de forbol, como el PMA, esta molécula se une a la quinasa en el mismo sitio que el dag, que es clave para su máxima actividad quinasa. En invertebrados la PKC ha sido muy poco estudiada y destacan los trabajos de Sossin y col. (1991,1993) quienes han purificado Ap1 I y Ap1 II, la primera es una isoforma de molusco similar a las cPKCBI y BII y la segunda a la isoforma nPKCE, de mamiferos. En M. galloprovincialis Barcia y cols. (1997) describieron la presencia de péptidos que eran reconocidos por anticuerpos contra las isoformas a,B y --- de mamiferos, ademas de actividad PKC sobre sustratos clasicos para esta quinasa. Con estos antecedentes y considerando la universalidad de la familia de las PKC en diferentes especies de ubicación filogenéticamente distante, se planteó como hipótesis la existencia de una isoforma de PKC en manto de mejillón que podría tener una amplia distribución en sus diferentes tejidos y que además podría ser estudiada en hemocitos, como modelo biológico de la respuesta inmune en invertebrados. Mediante tres pasos cromatógraficos sucesivos: columna de intercambio aniónico (DE52), gel filtración (S-200) y cromatografía de adsorción en hidroxilapatito (HTP), se purifico un péptido simple de aproximadamente 105 kDa de peso molecular (p105), con actividad quinasa de tipo nPKC, es decir, dependiente de PMA y PS, que además tiene la capacidad de autofosforilación sin mediar la estimulación de cofactores lipidocos.