Identificación de genes implicados en la eliminación de biotoxinas en el mejillón "Mytilus galloprovincialis Lmk"clonación y expresión de los cDNA que codifican para tres proteínas transportadoras ABC pertenecientes a las subfamilias C (proteína MRP) y G

Resumo

Los mejillones del género Mytilus viven en hábitats fluctuantes en los que su capacidad para adaptarse a los cambios del entorno es esencial para su supervivencia. Como organismos filtradores se alimentan sobre todo de fitoplancton y también de la materia orgánica en suspensión. En ocasiones el fitoplancton contiene especies tóxicas para el hombre o que producen efectos nocivos en los bivalvos. Una vez que las toxinas son ingeridas por los bivalvos pueden acumularse, transformarse y eliminarse. La biotransformación y eliminación de las toxinas o xenobióticos tiene lugar en varias fases en alguna de las cuales participan proteínas transportadoras ABC. Los transportadores pertenecientes a la superfamilia ABC (ATP-Binding Cassette) de proteínas, se encuentran en todos los organismos desde bacterias hasta humanos. Los miembros de esta familia están implicados en el transporte activo de numerosos compuestos estructuralmente diversos a través de la membrana celular. Entre ellos destacan los transportadores implicados en la resistencia múltiple frente a fármacos (MDR). En organismos acuáticos, expuestos a toxinas o contaminantes antropogénicos existe un fenómeno análogo llamado resistencia múltiple frente a xenobióticos (MXR). El objetivo de esta Tesis es demostrar la presencia de genes que codifican para proteínas ABC pertenecientes a las subfamilias ABCC y ABCG, y determinar su papel en los procesos de desintoxicación del mejillón (Mytilus galloprovincialis) frente a toxinas causantes de DSP (intoxicación diarreica por mariscos). Empleando diversas técnicas de biología molecular (PCR, RACE, clonación y secuenciación) obtuvimos las secuencias completas de los cDNA que codifican para dos proteínas transportadoras ABCC (MRP1 y MRP2) y una proteína ABCG (ABCG2). Asimismo, para llevar a cabo los estudios de expresión de estos genes, identificamos genes de referencia adecuados para normalizar los datos de expresión empleando los programas geNorm, NormFinder y BestKeeper. Mediante RT-qPCR analizamos la expresión de estos genes en diferentes tejidos y durante un proceso de intoxicación por toxinas DSP. Cuando comparamos los tres tejidos estudiados observamos que la expresión de los genes mrp1 y mrp2 es significativamente mayor en glándula digestiva y branquia que en manto sugiriendo el papel de estos tejidos en los procesos de desintoxicación, mientras que abcg2 tiene una expresión significativamente mayor en el manto que en los otros dos tejidos. En presencia de toxinas DSP, encontramos variaciones significativas en los niveles de expresión del gen mrp2 en glándula digestiva. El ácido okadaico induce significativamente la expresión del gen mrp2, dicha expresión llega a ser hasta 7,8 veces superior en presencia de la toxina que en el control. Por su parte, en branquia y manto no observamos inducción de la expresión de los genes mrp1, mrp2 y abcg2. Ello sugiere la implicación de la glándula digestiva en el metabolismo de los xenobióticos, mientras que la branquia y manto tienen una menor participación en la eliminación de metabolitos conjugados.