Caracterización de genes de la ostra plana "Ostrea edulis" modulados por bonamiosis y neoplasia diseminada

Resumo

El desarrollo sostenido de los cultivos de ostra plana, Ostrea edulis, atraviesa desde hace décadas por uno periodo de decadencia en las rías gallegas, debido entre otras causas a la práctica desaparición de los bancos naturales por la mala gestión realizada en los años 50 y 60, y a las importaciones masivas de ostras procedentes de otros países, con todos los problemas de mortalidad masiva que causó la introducción de nuevos patógenos. El problema más importante que afecta al proceso de engorde de ostra plana en el litoral gallego es la alta mortalidad provocada por el parásito Bonamia ostreae y Bonamia exitiosa. El parásito Bonamia infecta la ostra plana introduciéndose en los hemocitos, que son las células efectoras del sistema inmune de bivalvos; causando una alteración en dichas células y conduciendo eventualmente a su muerte e inhabilitación del individuo en su lucha contra el patógeno. Otra enfermedad que afecta a la ostra plana en Galicia es la neoplasia diseminada, una enfermedad que recuerda la leucemia de animales superiores. La neoplasia diseminada puede definirse como un crecimiento anormal del sistema hematopoyético de la ostra, caracterizada por la proliferación excesiva y anormal de células de la hemolinfa de la ostra que también resulta provisionalmente en la muerte del individuo afectado. El sistema inmune de bivalvos posee solamente lo que se denomina inmunidad innata o natural que es la respuesta temprana, no específica, que ocurre a las horas de contacto con el patógeno y no genera memoria inmunológica. La inmunidad innata puede clasificarse como inmunidad humoral (factores como las proteínas presentes en el suero) e inmunidad celular (células con actividad fagocítica). Uno de los objetivos que se abordan en esta tesis es la identificación y caracterización de genes inducidos en ostra plana frente a estas enfermedades, neoplasia diseminada y bonamiosis. Se secuenciaron ESTs (marcadores de secuencia expresada) de genes de los hemocitos de la ostra plana que se encontraban en ese momento expresándose en dichas células como posible respuesta a las enfermedades, mediante el uso de la técnica SSH (técnica de hibridación substractiva). Los ESTs obtenidos se clasificaron en funciones y se profundizó en aquellos genes relacionados con la defensa de la ostra plana y aquellos otros con funciones relevantes en sus homólogos vertebrados y desconocidos en los moluscos bivalvos. Con la técnica RACE (amplificación rápida del extremo de ADNc) se obtuvo la secuencia completa del tránscrito de un número de genes de interés. Mediante PCR cuantitativa se indagó en la expresión de varios de estos genes en las células de la hemolinfa de ostras que sufrían bonamiosis, neoplasia diseminada y ambas enfermedades a la vez; además de observarse la expresión en un número de tejidos de ostras planas sanas y en ostras enfermas. Se profundizó en las genes relacionados con la respuesta inmune: AIF (factor inflamatorio alográfico), TNF (factor de necrosis tumoral), dermatopontina y VAMP (proteínas de membrana asociadas a vesículas); y en los genes relacionados con procesos cancerígenos: XBP-1 (proteína de unión a la caja X), RACK (receptor de quinasa activada C), NDPk (nucleósido difosfato quinasa), C1q-TNF (molécula del complemento-factor de necrosis tumoral), RPA3 (proteína de replicación), SAP18 (proteína asociada a sin3a, proteína con hélices emparejadas anfipáticas), p23, ubiquitina y ferritina. También se estudió la expresión diferencial de microARNs relacionados con procesos inmunes de hemocitos de ostras infectados por Bonamia spp. Los microARNs son ARNs monocatenarios, con una longitud entre 21 y 25 nucleótidos, que poseen la capacidad de regular la expresión de otros genes mediante diversos procesos, como la degradación de tránscritos de ARNm. En este punto se utilizó la técnica de microarrays o microchips de ADN, se trata de una superficie sólida a la cual se le une una colección de fragmentos de ADN y su funcionamiento consiste básicamente en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica y la molécula diana, midiéndose esta unión generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen. Los microchips de ADN se utilizan con frecuencia para identificar genes con una expresión diferencial entre distintas condiciones físicas. Como resultado de este trabajo se obtuvieron un número elevado de secuencias de nucleótidos que se depositaron en GenBank (una base de datos pública de secuencias de ADN), y se obtuvieron ORFs (marco de lectura abierto) de ADN y microARNs implicados en varios procesos inmunológicos y neoplásicos de la ostra plana. El aumento de conocimiento de la defensa de la ostra plana frente a infecciones y la estrategia de lucha frente a la enfermedad neoplasia diseminada permitirá formular nuevas estrategias para el control de las enfermedades, lo que puede proporcionar una nueva herramienta para la gestión de los cultivos de ostra.