Identificación de genes implicados en la eliminación de biotoxinas en el mejillón "Mytilus galloprovincialis Lmk"clonación y expresión de los cDNA que codifican para dos proteínas transportadoras ABC pertenecientes a las subfamilias B (proteína MDR)

Resumo

La multirresistencia frente a xenobióticos (MXR), en organismos acuáticos expuestos a toxinas o contaminantes antropogénicos, es un fenómeno equivalente a la multirresistencia frente a fármacos (MDR), estudiada en líneas celulares tumorales resistentes a drogas anticancerígenas. Un xenobiótico es toda sustancia extraña o ajena a las que proceden de la composición normal de un organismo vivo. Un ejemplo serían las biotoxinas marinas, entre ellas el ácido okadaico (principal toxina de tipo diarreico - DSP). El proceso de desintoxicación tiene lugar frecuentemente en varias fases, en las que participan una serie de enzimas y transportadores de membrana. Este sistema funciona de forma prácticamente universal, desde arqueobacterias hasta la especie humana, donde ha sido fuertemente estudiada, debido a su implicación en tratamientos tumorales. Últimamente, se han realizado diversos estudios en organismos marinos, donde se analiza el funcionamiento y la inducción de este sistema frente a diversos contaminantes. Los genes de multirresistencia frente a xenobióticos (mxr) codifican para una serie de proteínas transportadoras de membrana, pertenecientes a la superfamilia de proteínas ABC (ATP-Binding Cassette), encargadas del transporte activo de la toxina o sus derivados, hacia el exterior de las células. Una de las encargadas de realizar esta función es la P-glucoproteína (P-gp, ABCB o MDR). La presencia de un sistema MXR en bivalvos, sumado a la estructura molecular del ácido okadaico, que cuadra perfectamente en el diseño de la amplia variedad de metabolitos, que se unen y son trasladados por este transportador, sugiere su consideración como un posible sustrato de la P-gp. Esto permite proponer la hipótesis de que este transportador podría estar implicado en la desintoxicación celular de moluscos durante los episodios tóxicos. En esta investigación se ha buscado la presencia de proteínas MDR en varios tejidos del mejillón (Mytilus galloprovincialis), mediante el estudio de los genes que las codifican. Para ello, se utilizaron determinadas herramientas de biología molecular, como la transcripción inversa, seguida por una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y de RACE-PCR (rapid amplificaction of cDNA ends-PCR). Finalmente, los fragmentos obtenidos fueron clonados y secuenciados. Se ha conseguido completar la secuencia del cDNA que codifica para dos proteínas de tipo MDR o P-gp, en el mejillón M. galloprovincialis, que presentaban los motivos conservados característicos de esta familia. En el gen mdr1, el cDNA está formado por 4271 pb y codifica para una proteína de un tamaño de 1307 aminoácidos, mientras que el cDNA del gen mdr2 consta de 4417 pb, que origina una proteína de 1367 aminoácidos. También se realizó un estudio de la expresión de estos genes en los diferentes tejidos del mejillón (glándula digestiva, branquia y manto), además de un análisis a lo largo de la evolución de un proceso de intoxicación-desintoxicación por toxinas DSP, que tuvo lugar en 2010 en las rías gallegas. Para ello, se utilizó la técnica de RT-qPCR, usando cebadores específicos de los fragmentos que se quieren amplificar. Para normalizar los resultados, se llevó a cabo un análisis de un grupo genes de referencia [NADH deshidrogenasa subunidad 4 (nd4); gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapdh); citocromo c oxidasa subunidad I (cox1); proteína de fusión ubiquitina - proteína ribosomal S27 (rps27); factor de iniciación de la traducción 5A (tif5a); 40S proteína ribosomal S4 (rps4); actina (act) y 18S RNA ribosomal (18S)], con el fin de encontrar aquellos que se mantengan más estables, a lo largo del experimento. Para ello, se usaron tres programas informáticos, que clasifican los genes examinados según su estabilidad: geNorm, NormFinder y BestKeeper. Tras los análisis con los tres programas, se propusieron los genes de referencia más estables, que se deberían usar para la normalización en cada uno de los casos. Serían: ¿ para los tres tejidos en conjunto (glándula digestiva, braquia y manto): gapdh, rps4, rps27 y cox1; ¿ para glándula digestiva y branquia: gapdh, rps4 y cox1; ¿ para manto: gapdh, rps4 y rps27. Tras comparar la expresión entre los tres tejidos, se observó que, para la mdr1, no se encontraron diferencias significativas, mientras que para la mdr2 era mayor en la branquia que en los otros dos tejidos. Esto puede ser debido a que es el primer lugar donde se produce el contacto entre las toxinas y el organismo, actuando como un tejido barrera que impide la entrada de este tipo de moléculas y expulsando aquellas que han sido asimiladas. Por otra parte, al analizar la expresión de estos genes durante el proceso de intoxicación-desintoxicación del mejillón por ácido okadaico, se observó que el gen mdr1 estaba significativamente más expresado, tanto en branquia como en la glándula digestiva, de los mejillones expuestos a altas concentraciones de toxinas DSP, en relación al control sin toxina, mientras que esta sobreexpresión, para mdr2, solo pudo ser observada en la branquia. En el manto no se encontraron cambios significativos de los niveles de expresión para ninguno de los genes. Estos resultados revelan que, probablemente, las proteínas transportadoras MDR actúen en las branquias como una barrera frente a las biotoxinas, evitando su entrada y eliminándolas hacia el exterior. Además, la sobreexpresión de mdr1 en glándula digestiva podría estar relacionada con una función protectora, mediante la expulsión directa de tóxicos, y con el transporte de metabolitos tras los procesos de biotransformación que tienen lugar en este órgano, donde se acumulan principalmente las biotoxinas marinas en moluscos bivalvos.