Diseño, síntesis y evaluación anticáncer de ligandos de receptor de la vitamina D con sustituyentes en C-12, C-17 y C-7

  1. Carballa Vallejo, Diego Mateo
Dirixida por:
  1. Antonio Mouriño Mosquera Director
  2. Mercedes Torneiro Abuin Director

Universidade de defensa: Universidade de Santiago de Compostela

Fecha de defensa: 05 de setembro de 2013

Tribunal:
  1. Pilar Goya Laza Presidente/a
  2. Manuel Amorín López Secretario
  3. Jose Enrique Rodriguez Borges Vogal
  4. Francisco A. Bermejo Vogal
  5. Antonio Rumbo Gómez Vogal

Tipo: Tese

Teseo: 349526 DIALNET

Resumo

Introduccción La vitamina D3, a través de su forma activa, la hormona 1¿,25-dihidroxivitamina D3 [1¿,25-(OH)2D3, 1,25D ó calcitriol], desempeña un papel fundamental en la homeostasis del calcio y el fósforo, y regula la proliferación y diferenciación celular, la apoptosis celular y el sistema inmune. Desafortunadamente, el uso de la 1,25D como fármaco se encuentra limitado por sus efectos calcémicos colaterales que producen un aumento de la reabsorción ósea y la calcificación de tejidos blandos (hipercalcemia). Este hecho ha impulsado el desarrollo de análogos sintéticos de la 1,25D con efectos terapéuticos similares o superiores pero con efectos calcémicos bajos o nulos. La mayoría de las acciones biológicas que realiza la 1,25D tienen lugar mediante la interacción con su receptor nuclear VDR y una posterior transcripción genética. Para el diseño racional de análogos activos de la 1,25D se viene utilizando en estos laboratorios la estructura cristalográfica del complejo 1,25D-VDR(LBD). 1 Diseño de análogos con sustituyentes en C-12, C-17 y C-7 Recientemente, se sintetizaron en estos laboratorios análogos activos de la 1,25D modificados en C-12 y C-6. Con objeto de mejorar el perfil biológico y profundizar en los estudios de correlación estructura-actividad, diseñamos una serie de análogos de la 1,25D con cadenas hidroxiladas en C-12, tanto con orientación ¿ (1a-c) como con orientación ß (2a-c y 3). Además, se propuso la síntesis de la 1¿,25-dihidroxi-7-metil-vitamina D3 (4). Los estudios de docking indicaron que los ligandos 2a-c poseen mayor afinidad por el VDR que la 1,25D, mientras que los ligandos 1a-c y 3 forman complejos con el VDR más débiles que la 1,25D. 2 Síntesis de análogos del calcitrol con sustituyentes en C-12 y C-17 2.1 Síntesis de los análogos 2a-c A partir del compuesto 50 se preparó 49a. El compuesto 50 se desprotegió selectivamente y el alcohol resultante se transformó en el yoduro 60 por tratamiento con I2, Ph3P e imidazol en THF. A continuación, el acoplamiento entre el yoduro 60 y acrilato de metilo seguido de metilación de 61 con MeMgBr y de protección con TESCl dio el compuesto 63, que se trató con ácido m-cloroperbenzoico obteniéndose el epóxido 64. El alcohol alílico 49a deseado se obtuvo por apertura del epóxido con dietilamiduro de litio en presencia de HMPA. La introducción estereoselectiva de la cadena en la posición C-12 se llevó a cabo vía transposición de Johnson-Claisen, siguiendo procedimientos utilizados anteriormente en estos laboratorios. La reacción entre el alcohol 49a y ortoacetato de trietilo en presencia de ácido propiónico como catalizador generó, vía 65, el éster ¿,¿-insaturado 48a. Para la construcción de las cadenas finales en C-12, primero se procedió a la hidrogenación catalítica del doble enlace entre las posiciones C-9 y C-11. La elongación de dos carbonos a partir de 66 dio el éster 47a siguiendo la secuencia: reducción del éster, reacción de Horner-Wadsworth-Emmons sobre el aldehído resultante, hidrogenación y desprotección. Para la elongación de tres carbonos a partir de 66 se siguió una secuencia similar a la descrita para la construcción de la cadena en C-17. La reducción del éster 66 con DIBAL-H condujo al alcohol 70, que se transformó en el yoduro 71. El acoplamiento entre 71 y acrilato de metilo en presencia de Zn, NiCl2·6H2O y piridina, dio el éster 72, que se trató con HF para dar 47b. Por último, para construir la cadena lateral de seis carbonos se partió del éster 69 siguiendo la secuencia utilizada para la síntesis de 47a. La oxidación de los dioles 47a-c seguido de reacción de Wittig entre cada cetona y el iluro de fósforo Ph3P=CHBr dio los correspondientes bromuros vinílicos 76a-c. Los bromuros vinílicos se transformaron en los correspondientes boronatos 46a-c por reacción de Miyaura con bis(pinacolato)diborano. Finalmente, se completó la síntesis de los análogos correspondientes a partir del enol triflato 18a (precursor del anillo A) y los boronatos 46a-c. La reacción de carbociclación-acoplamiento del enol triflato 18a con los correspondientes boronatos 46a-c condujo a los correspondientes análogos 77a-c, protegidos como éteres de silicio en las posiciones C-1 y C-3. A continuación, la metilación de seguida de desprotección proporcionó los análogos deseados 1a-c. Los estudios biológicos de 1a-c se realizaron en los laboratorios del Prof. Hector F. DeLuca (Universidad de Wisconsin). Los análogos 1a-c poseen una afinidad por el VDR dos órdenes de magnitud inferior a la hormona natural, lo que concuerda con los datos obtenidos in silico. Además, tampoco inducen la transcripción mejor que la hormona natural. Los estudios realizados en ratones mostraron que el análogo 1a resultó ser más calcémico que la hormona natural, mientras que los análogos 1b-c poseen una actividad calcémica ligeramente inferior. Se puede concluir que la introducción de cadenas laterales hidroxiladas en la posición C-12¿ no mejoró las propiedades biológicas de la hormona natural. Solamente se puede destacar que el análogo 1a retiene el 35% de actividad transcripcional aunque, desafortunadamente, este análogo resulto ser más calcémico que el calcitriol. 2.2 Síntesis de los análogos 2a-c. Para la introducción de la cadena en C-12, se siguieron metodologías utilizadas anteriormente para preparar compuestos similares. El enino 80 se obtuvo a partir del alcohol 81. La etapa clave fue la reacción de Sonogashira entre el enol triflato 88 y el alquino terminal 89. El triol clave 79a se obtuvo mediante una secuencia de 2 pasos que incluye: hidrogenación catalítica del enino 80 seguido de desprotección de 91. Para la síntesis de los trioles 79b-c se partió del triol 79a por elongación de uno y dos carbonos. La elongación de un carbono se realizó por tosilación selectiva del hidroxilo primario de 79a y desplazamiento del tosilo resultante 92 con KCN que condujo al nitrilo 93, el cual se redujo al alcohol 79b con DIBAL-H. Para la elongación de dos carbonos se repitió la secuencia sintética utilizada anteriormente, pero en este caso a partir del triol 79b. A continuación, se prepararon los ésteres borónicos correspondientes 78a-c a partir de los trioles 79a-c en 4 pasos que incluyen: protección selectiva, oxidación, reacción de Wittig y borilación de Miyaura. La síntesis de 2a-c se completó mediante carbociclación-acoplamiento de Suzuki del enol triflato 18a con cada uno de los boronatos 78a-c, seguido de desprotección con TBAF. Los análogos 2a-c se enviaron a los laboratorios del Prof. Alberto Muñoz (Instituto de Investigaciones Biomédicas ¿Alberto Sols¿-CSIC, Madrid) para su evaluación en líneas tumorales SW480-ADH de cáncer de colon, y a los laboratorios del Prof. Román Pérez (Departamento de Fisiología-Facultad de Medicina, Universidad de Santiago de Compostela) para los estudios de afinidad por el VDR, inducción de la transcripción, proliferación celular en líneas tumorales MCF-7 de cáncer de mama y estudios calcémicos en ratones. Los ensayos de afinidad por el VDR mostraron que los análogos poseen una afinidad aproximadamente 10 veces menor que la hormona natural. Además, todos los análogos inducen la transcripción a concentraciones ligeramente más altas que la 1,25D. Además, el análogo 2a (10-7 M) inhibe la proliferación celular de manera similar a la 1,25D en líneas tumorales MCF-7. Los ensayos llevados a cabo en líneas tumorales SW480-ADH mostraron que los tres análogos poseen una acción pro-diferenciadora comparable a la de la hormona a concentraciones de 10-7 M. Los datos obtenidos en los ensayo in vivo indicaron que los análogos 2a-c no incrementan los niveles de calcio en ratones. Tampoco se observaron cambios en el peso de los ratones. Como conclusión podemos decir que los análogos 2a-c poseen una afinidad por el VDR menor que la de la hormona natural, lo cual no concuerda con los datos obtenidos in silico. A pesar de ello, los ensayos biológicos in vitro demostraron que los tres compuestos presentan actividades pro-diferenciadoras, antiproliferativas y trancripcionales comparables a la 1,25D. Los tres análogos poseen menores efectos calcémicos in vivo menores que el calcitriol lo que unido a sus propiedades in vitro los hace de potencial interés terapéutico. 2.3 Síntesis del análogo 3 La síntesis del éster borónico 99 se realizó a partir del triol 79a anteriormente sintetizado. Primero se construyó la cadena lateral en la posición C-17. Para ello, se realizó una elongación de tres átomos de carbono a partir del triol 79a, por yodación selectiva y acoplamiento del yoduro 100 con acrilato de metilo en presencia de Zn, NiCl2·6H2O y piridina, obteniéndose el éster metílico 101. A continuación se preparó el éster borónico 99. La oxidación de 101 seguido de reacción de Wittig de la cetona resultante con el iluro Ph3P=CHBr proporcionó el bromuro vinílico 103, que se transformó en el éster borónico 99 por borilación con bis(pinacolato)diborano. La síntesis se análogo se completó en 3 pasos por carbociclación-acoplamiento de Suzuki seguido de metilación del éster en la posición C-25 y desililación de los hidroxilos del anillo A. El análogo 3 se envió a los laboratorios del Prof. David Feldman (Universidad de Stanford-California) para su evaluación biológica. Los resultados de los ensayos preliminares mostraron que el análogo 3 posee menor afinidad por el VDR que la 1,25D, lo que concuerda con los datos obtenidos in silico. 3 Síntesis de la 1¿,25-(OH)2-7-metil-D3 (4) Para la preparación del boronato 104a (precursor del biciclo CD) se planteó utilizar como sustancia de partida el aleno 113b que se preparó a partir de la cetona 31. La protección de 31 con cloruro de bencildimetilsililo seguida de reacción de Wittig sobre la cetona 107a, con el iluro Ph3P=CH2, condujo al compuesto 114a, el cual se trató con terc-butóxido potásico y bromoformo para dar el ciclopropano 115a. Este se transformó en el aleno 113b por reacción con metil litio en Et2O a 0 ºC. Desafortunadamente, la hidroboración catalítica de 113b no proporcionó los resultados esperados. Se obtuvo el producto deseado 104b, mezclado con otros regioisómeros, y el compuesto 116a. Por lo tanto se decidió una ruta de síntesis alternativa para 104b. La reacción del aleno 113b con HSnPh3 en tolueno, utilizando una cantidad catalítica de Et3B como generador de radicales, proporcionó regioselectivamente el vinilestannano 119 como único producto. Para la preparación de 104b, en primer lugar, el compuesto 119 se transformó en el yoduro vinílico 121 por tratamiento con N-yodosuccinimida. A continuación, la metalación del yoduro 122 con tBuLi a -78 ºC, seguido de atrapado del anión con triisopropóxido de boro y transesterificación con pinacol condujo al éster borónico 104b. Una vez obtenido el boronato 104b se completó la síntesis del análogo 4. La reacción de carbociclación-acoplamiento de Suzuki entre el enol triflato 18a y el éster borónico 104b seguida de desprotección con TBAF en THF proporcionó el análogo 4. Como se había previsto, el análogo 4 se equilibra con su forma previtamínica pre-4. Conclusiones Se han diseñado vía cálculos de docking, utilizando la estructura cristalográfica del complejo VDR(LBD), los análogos de la 1,25D: 1a-c, 2a-c y 3, con sustituyentes en las posiciones C-12 y C-17. Los estudios de docking indican que los análogos 2a-c se unen al receptor de la vitamina D con una afinidad mayor que la de la hormona natural y que el hidroxilo de la cadena lateral en la posición C-12 forma enlace de hidrógeno con la His305. En el caso del análogo 2b también existe interacción con la His397. Los análogos 1a-c y 3 poseen una afinidad por el VDR más moderada que la de la hormona natural. Sin embargo, las cadenas laterales de la posición C-12 establecen interacciones adicionales con otros residuos del VDR distintos a los habituales. Se han sintetizado los análogos 1a-c, 2a-c y 3 utilizando la ruta de carbociclación-acoplamiento de Suzuki catalizado por Pd(0) para la construcción del sistema triénico. Los ensayos biológicos realizados para los compuestos 1a-c y 2a-c mostraron que la modificación introducida para los análogos 1a-c no produjo mejoras en las propiedades biológicas, mientras que los análogos 2a-c presentan actividades pro-diferenciadoras, antiproliferativas y trancripcionales comparables a las de la 1,25D. Los tres análogos son menos calcémicos que la 1,25D, por lo que son de potencial interés clínico. Se ha sintetizado el análogo 1¿,25-(OH)2-7-metil-D3 (4), que constituye el primer ejemplo de un análogo con sustituyentes en la posición C-7. El sistema triénico se construyó vía carbociclación-acoplamiento de Suzuki. El fragmento superior se obtuvo vía estannilación regio- y estereoselectiva de alenos. El análogo 4 se equilibra con su forma previtamínica (pre-4) en CD3OD a temperatura ambiente. Al cabo de 178 h el análogo 4 se transforma totalmente en su forma previtamínica. Bibliografía (1) (a) Mellanby E, Cantag MD. Experimental investigation on rickets. Lancet 1919, 196, 407-412. (b) Mellanby E. Experimental Rickets. Med Res. (G.B.), Special Report Series 1921, SRS-61, 1-78. (2) McCollum EV, Simmonds N, Becker JE, and Shipley PG, Studies on experimental rickets. XXI. An experimental demonstration of the existence of a vitamin which promotes calcium deposition. J. Biol. Chem. 1922, 53, 293-312. (3) (a) Lund J, DeLuca HF. Biologically active metabolite of vitamin D3 from bone, liver, and blood serum. J. Lipid Res. 1966, 7, 739-744. (b) Morii H, Lund J, Neville PF, DeLuca HF. Biological activity of a vitamin D metabolite. Arch. Biochem. Biophys. 1967, 120, 508-512. 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