The sea lamprey monoaminergic systemperipheral organization, origin of the afferents to the spinal cord and relationship with other neurotransmitter systems

Resumo

Las monoaminas serotonina y dopamina son neurotransmisores que modulan diversas funciones en el sistema nervioso de los vertebrados. Las lampreas pertenecen al grupo de vertebrados actuales más primitivo, los vertebrados sin mandíbula o agnatos. Por lo tanto, ocupan un lugar filogenético clave en la raíz de los vertebrados, lo cual hace que sean animales modelo interesantes para estudiar la evolución del sistema nervioso. Además, las lampreas también resultan animales modelo muy interesantes para el estudio de mecanismos de regeneración del sistema nervioso, para estudiar los circuitos neuronales que subyacen al proceso de locomoción en vertebrados o para ser usadas para determinar el papel patogénico que juegan diferentes moléculas en enfermedades del sistema nervioso. Por lo tanto, la investigación de tipo neuroanatómica en lampreas proporcionará información acerca de la organización y el desarrollo del sistema nervioso que servirá de base para llevar a cabo otro tipo de estudios neurobiológicos. En esta tesis, hemos intentado avanzar en el conocimiento y organización de los sistemas de neurotransmisores de las lampreas centrándonos en la organización del sistema monoaminérgico. En estudios previos de nuestro grupo hemos publicado el desarrollo y organización de los sistemas inmunorreactivos a serotonina y dopamina en el sistema nervioso central de la lamprea de mar (Abalo y col., 2005, 2007). En esta tesis hemos estudiado nuevos aspectos de estos sistemas: la organización periférica del sistema serotonérgico, el origen de la inervación monoaminérgica descendente a la médula espinal de la lamprea de mar y la coexistencia de serotonina o dopamina y GABA en neuronas del cerebro de la lamprea de mar. En el primer capítulo de la tesis se describe la organización del sistema serotonérgico periférico de la cabeza de larvas y adultos de lamprea de mar. Se observó la presencia de diferentes tipos celulares serotonérgicos y una compleja red de fibras serotonérgicas en los diferentes tejidos de la cabeza. Entre las diferentes estructuras conteniendo células serotonérgicas nos hemos centrado en la caracterización neuroquímica de las papilas gustativas de la lamprea de mar. No se observó la presencia de estructuras catecolaminérgicas en la cabeza de la lamprea de mar a excepción de en su sistema nervioso central. En el segundo capítulo se presentan los resultados relacionados con la investigación del origen de la inervación serotonérgica y dopaminérgica descendente a la médula espinal de la lamprea de mar. Además, como fruto de esta investigación se han encontrado nuevos núcleos cerebrales, principalmente 251 Summary and conclusions formados por células de tipo CSF-c, que no se habían descrito previamente como de innervación descendente a la médula. Finalmente los resultados relacionados con la investigación de la presencia de colocalización de serotonina o dopamina y GABA en determinados grupos de neuronas del cerebro de la lamprea se presentan en el último capítulo. Todos los capítulos de esta Tesis Doctoral han sido previamente publicados en forma de artículos de investigación con la siguientes referencias: ¿ Capítulo 1.1: J Comp Neurol (2009) 512: 478-499. ¿ Capítulo 1.2: J Comp Neurol (2008) 511: 438-453. ¿ Capítulo 2.1: J Comp Neurol (2008) 511: 711-723. ¿ Capítulo 2.2: J Chem Neuroanat (2008) 36: 77-84. ¿ Capítulo 3.1: J Anat (2009) 215: 435-443. ¿ Capítulo 3.2: J Anat (2009) 215: 601-610. Para la realización de este proyecto de tesis se han empleado técnicas de inmunofluorescencia para la caracterización de las neuronas y fibras monoaminérgicas u otros tipos celulares; para ello se usaron anticuerpos generados contra diferentes marcadores neuronales (serotonina, dopamina, GABA, glutamato, tirosina hidroxilasa, NPY, calretinina o tubulina acetilada). La técnica de cromatografía líquida de alta precisión se usó para confirmar bioquímicamente la presencia de monoaminas en la cabeza de la lamprea de mar sin el cerebro ni la médula espinal. Anticuerpos contra diferentes marcadores neuronales (calretinina o tubulina acetilada) se emplearon para la caracterización de las estructuras monoaminérgicas y sus patrones de innervación. Métodos de trazado neuronal (usando neurobiotina o dextranaminas biotiniladas como trazadores retrógrados) en combinación con inmunofluorescencia contra serotonina o dopamina se usaron para determinar el origen de la innervación monoaminérgica descendente a la médula espinal. Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Santiago de Compostela y cumplieron las normas de la Unión Europea sobre cuidado y experimentación animal. 252 Summary and conclusions CAPÍTULO 1.1. ELEVADA PRESENCIA DE CÉLULAS Y FIBRAS SEROTONÉRGICAS EN EL SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO DE LAS LAMPREAS. Las lampreas son animales modelo muy adecuados para el estudio de la evolución del sistema nervioso de los vertebrados porque pertenecen al grupo de vertebrados actuales más temprano, los agnatos. La organización general del sistema nervioso central serotonérgico se conoce muy bien en las lampreas, pero falta información acerca de su organización periférica. En este estudio se emplearon técnicas de cromatografía líquida de alta precisión y técnicas de inmunohistoquímica, usando un anticuerpo contra serotonina, para determinar la presencia de elementos serotonérgicos en la cabeza de larvas de lamprea de mar. Lampreas adultas también fueron analizadas con el objetivo de comparar la organización del sistema entre los estadios larvario y postmetamórfico. Se observó la presencia de células serotonérgicas en los ganglios de los nervios craneales, la musculatura, las papilas gustativas y las branquias. En todos los tejidos a excepción de la epidermis se observó una amplia presencia de fibras serotonérgicas. Se propusieron diferentes papeles que podrían desempeñar los diferentes tipos celulares descritos en función de su localización, estructura o patrones de inervación. Las células serotonérgicas de la lamprea parecen estar implicadas en procesos de quimiorecepción de oxígeno y gusto, en la modulación de la contracción muscular y en la regulación del batido ciliar y la secreción de mucus. La amplia presencia de elementos serotonérgicos en el sistema nervioso periférico de las lampreas sugiere una relación muy cercana con la organización de este sistema en grupos de invertebrados. 253 Summary and conclusions CAPÍTULO 1.2. CARACTERIZACIÓN NEUROQUÍMICA DE LAS PAPILAS GUSTATIVAS Y DE LAS FIBRAS GUSTATIVAS AFERENTES DE LA LAMPREA DE MAR. PRESENCIA DE INMUNOREACTIVIDAD A SEROTONINA, CALRETININA Y CGRP EN CÉLULAS BI-CILIADAS DE LAS PAPILAS GUSTATIVAS DE LOS VERTEBRADOS MÁS TEMPRANOS. Se ha sugerido que sustancias neuroactivas como la serotonina y otras monoaminas podrían estar involucradas en la transmisión de las señales del gusto desde las células que forman las papilas gustativas a las fibras aferentes. Las lampreas son los vertebrados más tempranos que poseen papilas gustativas, aunque la estrucutura de las mismas difiere con respecto a la de los vertebrados con mandíbula y su neuroquímica no es conocida. Hemos empleado métodos de inmunofluorescencia con anticuerpos generados contra serotonina, tirosina hidroxilasa (TH), GABA, glutamato, péptidos relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), neuropéptido Y (NPY), calretinina y tubulina acetilada para caracterizar la neuroquímica y la innervación de las papilas gustativas en la lamprea de mar, Petromyzon marinus L. Para determinar la localización de las células proliferativas en las papilas gustativas empleamos marcaje con bromodesoxiuridina (BrdU, detectado por inmunohistoquímica) e inmunohistoquímica contra el antígeno nuclear de proliferación celular. Los resultados con ambos marcadores indican que las células proliferantes se restringen a unas pocas células basales y que casi todas las células en las papilas gustativas no son proliferantes ya en estados tempranos de desarrollo. Se observó la presencia de un gran número de células bi-ciliadas inmunorreactivas a serotonina, calretinina y CGRP en las papilas gustativas de la lamprea de mar. Esto sugiere que la serotonina participa en la transmisión de las señales gustativas e indica que esta sustancia apareció en este sistema tempranamente durante la evolución de los vertebrados. Fibras inmunorreactivas a ¿-tubulina contactan la superficie basal de las células bi-ciliadas de las papilas gustativas. Varias de las fibras que rodean las papilas presentaron inmunorreactividad a calretinina. Las células de las papilas gustativas o las fibras aferentes no presentaron inmunorreactividad a TH, GABA, glutamato o NPY, lo que sugiere que la expresión de estas sustancias apareció en las papilas gustativas de diversas líneas de gnatóstomos después de la separación de gnatóstomos y lampreas. 254 Summary and conclusions CAPÍTULO 2.1. PROYECCIONES CEREBRO-ESPINALES DESCENDENTES EN UN VERTEBRADO PRIMITIVO, LA LAMPREA: NEURONAS CONTACTANTES DEL LÍQUIDO CEREBROESPINAL Y DOPAMINÉRGICAS. Usamos la neurobiotina como trazador neuronal retrógrado tanto en larvas como en adultos de lamprea de mar y se observó la presencia de un alto número de poblaciones del tronco cerebral (principalmente núcleos reticulares, octavos y diencefálicos) que proyectan a la médula espinal, en concordancia con resultados publicados previamente con otros trazadores. También se observó la presencia de pequeñas neuronas en el hipotálamo ventral, la región mamilar y en el núcleo paratubercular; estos núcleos no fueron previamente reconocidos como de proyección espinal. La mayoría de las células de la región mamilar y varias del hipotálamo ventral son neuronas contactantes del líquido cerebroespinal (CSF-c). La inmunohistoquímica combinada con trazado neuronal mostró que parte de las neuronas marcadas en los núcleos mamilar y paratubercular son inmunorreactivas a dopamina. Además se marcaron varias células CSF-c del rombencéfalo caudal y la médula espinal rostral siendo parte de ellas inmunorreactivas a dopamina. Resultados con otros trazadores (dextranaminas biotiniladas, peroxidasa de rábano y DiI) también demostraron que el peso molecular o la naturaleza del trazador es determinante a la hora de revelar células diencefálicas con axones muy finos. Los resultados muestran que los sistemas descendentes aferentes a la médula espinal en lampreas son más variados que lo previamente descrito y revelan una proyección descendente desde células CSF-c, lo cual es desconocido en los vertebrados. Estos resultados también revelan la existencia de grandes diferencias entre agnatos y gnatóstomos en la organización de células dopaminérgicas que proyectan a la médula espinal. 255 Summary and conclusions CAPÍTULO 2.2. DESARROLLO Y ORGANIZACIÓN DE LAS PROYECCIONES DESCENDENTES SEROTONÉRGICAS DESDE EL TRONCO CEREBRAL A LA MÉDULA ESPINAL EN LA LAMPREA DE MAR. Se emplearon técnicas de doble marcaje, mediante métodos de trazado neuronal e inmunocitoquímica contra serotonina, para investigar la organización y desarrollo de las proyecciones descendentes desde neuronas serotonérgicas rombencefálicas a la médula espinal. Los resultados obtenidos mostraron que dos poblaciones serotonérgicas de las regiones reticulares ístmica y vagal presentan neuronas reticuloespinales desde el inicio del periodo larvario. De las tres subpoblaciones del grupo reticular ístmico, sólo dos, las subpoblaciones medial y ventral proyectan a la médula espinal, con la mayoría de las células de proyección situadas en la parte caudal de la subpoblación ístmica medial. Sólo ocasionalmente se observó la presencia de células de proyección a la médula espinal en la subpoblación ventral. El núcleo reticular vagal serotonérgico, que está situado en el rombencéfalo caudal, también presenta células de proyección descendente. El desarrollo temprano de las proyecciones serotonérgicas desde el tronco cerebral a la médula espinal parece ser una característica conservada en todos los vertebrados estudiados. Aunque un sistema de proyección rombencéfalico-espinal parece haberse desarrollado antes de la divergencia de agnatos y gnatóstomos, no se observaron células serotonérgicas en la región rafeal en la lamprea. Además se observó que, proporcionalmente, más células serotonérgicas del rombencefálo rostral contribuyen a la proyección espinal en la lamprea de mar que en vertebrados con mandíbula. 256 Summary and conclusions CAPÍTULO 3.1. LA SEROTONINA Y EL GABA COLOCALIZAN EN DETERMINADOS GRUPOS DE NEURONAS DEL CEREBRO DE LARVAS DE LAMPREA DE MAR: EVOLUCIÓN TEMPRANA DE LA COLOCALIZACIÓN DE NEUROTRANSMISORES EN LOS VERTEBRADOS. Se ha publicado previamente la existencia de colocalización de los neurotransmisores clásicos serotonina (5-HT) y ácido ¿-aminobutírico (GABA) (o de la enzima que sintétiza este ultimo, descarboxilasa del glutamato) en unas pocas neuronas del núcleo del rafe magno-oscuro de la rata. Sin embargo no hay datos acerca de la presencia de neuronas neuroquímicamente similares en el cerebro de vertebrados no mamíferos. Las lampreas son los vertebrados actuales más antiguos y pueden proporcionar datos importantes a cerca de la filogenia de los sistemas neuroquímicos. La colocalización de 5-HT y GABA en neuronas del cerebro de la lamprea de mar se estudió con doble inmunofluorescencia usando anticuerpos contra serotonina y GABA y microscopia confocal. La colocalización de estos neurotransmisores se observó en el diencéfalo y el istmo. En el diencéfalo, alrededor del 87% de las células serotonérgicas de la capa rostral del tálamo dorsal (cerca de la zona limitans) mostraron inmunorreactividad a GABA. Además, ocasionalmente se observó la presencia de células doblemente marcadas para GABA y 5-HT en el núcleo hipotalámico tuberal y en el pretecho. De los 3 subgrupos serotonérgicos ístmicos previamente reconocidos en el istmo de la lamprea de mar (dorsal, medial y ventral), células doblemente marcadas se observaron únicamente en el subgrupo ventral (alrededor del 61% de las células serotonérgicas del subgrupo ventral mostraron inmunorreactividad a GABA). Estos resultados sugieren una equivalencia entre estas células ístmicas de la lamprea y las células rafeales serotonérgicas/GABAérgicas de los mamíferos. Nuestros resultados sugieren que las neuronas serotonérgicas/GABAérgicas son proporcionalmente más abundantes en lampreas que en la rata y que probablemente aparecieron en la evolución antes de la separación de agnatos y gnatóstomos. Proponemos la cotransmisión mediante la liberación de 5-HT y GABA por parte de las neuronas aquí descritas. 257 Summary and conclusions CAPÍTULO 3.2 LA DOPAMINA Y EL GABA COLOCALIZAN EN DETERMINADOS GRUPOS DE NEURONAS DEL CEREBRO DE LA LAMPREA DE MAR: EVOLUCIÓN TEMPRANA DE LA COLOCALIZACIÓN DE NEUROTRANSMISORES EN LOS VERTEBRADOS. Durante los últimos años la posible coliberación de neurotransmisores desde una misma neurona ha recibido mucha atención. La colocalización de monoaminas y neurotrasmisores aminoacidérgicos (sobre todo glutamato y dopamina (DA) o serotonina) ha sido previamente observada en neuronas de mamíferos. Sin embargo, se ha prestado menos atención al estudio de la colocalización de la DA y el ácido ¿- aminobutírico (GABA). Con el objetivo de arrojar luz sobre la colocalización de neurotransmisores durante la filogénica de los vertebrados tempranos estudiamos la expresión de GABA en neuronas dopaminérgicas en el cerebro de la lamprea de mar mediante métodos de doble inmunofluorescencia con anticuerpos anti-DA y anti- GABA. Se observaron diferentes grados de colocaliación de DA y GABA en los diferentes núcleos dopaminérgicos del cerebro. Se observó un alto grado de colocalización (el GABA está presente al menos en el 25% de la neuronas DAinmunorreactivas) en poblaciones del rombencéfalo caudal, el istmo ventral, el núcleo de la comisura postóptica, el núcleo preóptico y en células grano de los bulbos olfativos. Se observó la presencia de una nueva población estriatal DA-inmunorreactiva que mostró colocalización con GABA en aproximadamente una cuarta parte de sus neuronas. A pesar de la abundacia de neuronas inmunorreactivas a DA y GABA en el hipotálamo periventricular, la colocalización se observó unicamente en unas pocas células. No se observó la presencia de células doblemente marcadas en el núcleo paratubercular. La frecuente colocalización de DA y GABA indica que las poblaciones dopaminérgicas de las lampreas son más complejas que lo previamente descrito. Se observó la presencia de fibras y terminales doblemente marcados en diferentes regiones del cerebro, lo que sugiere la posibilidad de coliberación de DA y GABA por parte de este tipo de neuronas de las lampreas. Estos resultados sugieren que la colocalización de DA y GABA en neuronas apareció tempranamente en la evolución de los vertebrados. 258 Summary and conclusions CONCLUSIONES A partir de los resultados obtenidos en esta Tesis hemos extraído las siguientes conclusiones: 1. Las lampreas tiene una compleja red de células y fibras serotonérgicas en el sistema nervioso periférico que nunca había sido descrita en otras especies de vertebrados. La gran presencia de elementos serotonérgicos en el sistema nervioso periférico de las lampreas sugiere una relación muy próxima con respecto a la organización de este sistema en grupos de invertebrados. 2. La organización, la morfología y el patrón de innervación de las células serotonérgicas del sistema nervioso periférico de la lamprea de mar indica que podrían participar en procesos de quimiorecepción de oxígeno y gusto, en la modulación de la contracción muscular y en la regulación de la frecuencia del batido ciliar y secreción de mucus. 3. El neurotransmisor serotonina parece tener un papel similar en la transmisión y/o respuesta a situaciones de hipoxia en todos los vertebrados estudiados incluidas las lampreas. 4. La preponderancia de elementos serotonérgicos en la cabeza y la compleja metamorfosis de las diferentes estructuras de la cabeza en lampreas sugiere que la serotonina podría jugar un papel en el desarrollo y morfogénesis de la cabeza como se ha sugerido previamente en los mamíferos. 5. La serotonina aparece como el neurotransmisor que probablemente es empleado por las células bi-ciliadas receptoras del gusto para la transmisión de la información gustativa en lampreas, mientras que en mamíferos actúa como un neuromodulador. Además el CGRP podría actuar como un neuromodulador durante la transmisión de la información gustativa en lampreas. 6. Experimentos de trazado neuronal demostraron que pequeñas neuronas, en el hipotálamo ventral, la región mamilar (siendo la mayor parte de ellas células contactantes del líquido cerebroespinal) y en el núcleo paratubercular, proyectan a la médula espinal en las lampreas. La presencia de células contactantes del líquido cerebroespinal que proyectan desde el cerebro a la médula espinal probablemente es una característica única de la lampreas. 7. Los resultados actuales revelan la existencia de grandes diferencias entre agnatos y gnatóstomos en la organización de las células dopaminérgicas que proyectan a 259 Summary and conclusions la médula espinal. Por otro lado, la combinación de experimentos hodológicos e inmunohistoquímicos confirma la equivalencia entre el núcleo paratubercular de las lampreas y núcleo del tubérculo posterior de otros vertebrados. 8. Aunque un sistema serotonérgico de proyección tronco cerebral-médula espinal parece haber estado presente antes de la divergencia de agnatos y gnatóstomos, no se observó la presencia de células serotonérgicas en la región rafeal en la lamprea. El desarrollo temprano de las proyecciones serotonérgicas desde el tronco cerebral a la médula espinal parece ser una característica conservada en todos los vertebrados estudiados. 9. Proporcionalmente más células serotonérgicas del rombencéfalo rostral contribuyen a la proyección espinal en la lamprea de mar que en los vertebrados con mandíbula. 10. Los resultados de colocalización indican que las neuronas serotonérgicas/GABAérgicas son proporcionalmente más numerosas en la lamprea de mar que en la rata e indican también que este tipo celular apareció antes de la separación de agnatos y gnatóstomos. Los resultados hodológicos y de colocalización también sugieren una equivalencia entre la células serotonérgicas ístmicas de la lamprea de mar y las células del rafe superior de los mamíferos. 11. Se propone la cotransmisión mediante la liberación de serotonina y GABA por parte de las neuronas diencéfalicas e ístmicas de la lamprea que muestran colocalización. 12. La presencia de fibras y terminales doblemente marcados con anticuerpos contra DA y GABA en diferentes regiones del cerebro sugiere la posible coliberación de estos neurotransmisores por parte de diversas neuronas de la lamprea. La comparación de estos sistemas en vertebrados sugiere que la colocalización de DA y GABA en neuronas apareción tempranamente en la evolución de los vertebrados. 13. Los resultados de colocalización indican que el sistema GABAérgico de las lampreas es más complejo que lo anteriormente publicado y que la colocalización/cotransmisión de GABA con otros neurotransmisores clásicos en neuronas del cerebro de los vertebrados es probablemente la norma y no la excepción.