Optimización del método de recuperación de ovocitos para la fecundación in vitro

Zusammenfassung

La producción de embriones in vitro es una de las biotecnologías con mayor potencial aplicativo en la producción bovina. Sin embargo, este proceso sólo permite obtener el 30¿40% de blastocistos de los ovocitos utilizados, lo que demuestra ser poco eficiente para su empleo a escala comercial. Dentro de los múltiples factores causales, la cantidad y calidad de los ovocitos empleados representa uno de los principales elementos a tener en cuenta. Por ello, en el intento de optimizar el método de recuperación de ovocitos de ovarios procedentes de animales sacrificados en el matadero para la fecundación in vitro, se consideró que factores como la técnica de recuperación de ovocitos, la aptitud productiva, la fase del ciclo estral, la edad y el peso de los ovarios pueden influir en la cantidad y calidad de ovocitos. Para tal fin, hemos utilizado cuatro ensayos. El objetivo del primer trabajo fue determinar la eficiencia en la obtención de ovocitos a partir de ovarios procedentes de hembras bovinas sacrificadas en matadero, según su aptitud productiva y en función de la técnica utilizada. Se recogieron los ovarios de un matadero de la provincia de Lugo durante los meses diciembre 2010 hasta febrero 2011. Los ovarios fueron divididos en dos grupos: Grupo I (n=180), ovarios procedentes de animales de aptitud cárnica y Grupo II (n=180), ovarios procedentes de animales de aptitud lechera. Cada grupo de ovarios se volvió a dividir al azar en dos grupos, en los que se aplicó una técnica diferente de recuperación de ovocitos (slicing o aspiración). La clasificación de los ovocitos recolectados se realizó en función del número y compactación de las células del cúmulo, así como del grado de homogeneidad y color del citoplasma, estableciendo cinco categorías (A, B, C, D y E). Se recuperaron una media de 6,4±2,4 y 11,2±4,3 ovocitos mediante las técnicas de aspiración y slicing, respectivamente (P<0,05). Así también, el mayor número de ovocitos de calidad superior fue recuperado por la técnica de slicing (63%) que por la de aspiración (47%). A pesar de que el procedimiento de slicing parecía ser más lento, esta técnica aumentaba la eficiencia del proceso, ya que se obtenía un mayor número de ovocitos de calidad superior por unidad de tiempo. Por otro lado, la aptitud productiva de los animales no presentó ninguna influencia sobre la recuperación de ovocitos, ni en la cantidad ni en la calidad. Después de haber comprobado que la técnica de slicing resultaba ser la más adecuada para la recuperación de ovocitos en número y calidad, se diseñó el ensayo 2 para determinar la posible influencia del peso de los ovarios, de la aptitud productiva y de la fase del ciclo estral sobre la recolección de ovocitos. Para lo que, se recuperaron 105 pares de ovarios durante los meses de febrero y marzo 2011, en un matadero local de la provincia de Lugo. Los pares de ovarios se separaron según la aptitud productiva del animal (carne o leche), y posteriormente en función de la fase del ciclo estral (lútea o folicular). Los ovocitos fueron obtenidos por la técnica de slicing y clasificados en las cinco categorías ya mencionadas. En esta experiencia se observó que el peso ovárico influía en todos los parámetros evaluados, por lo que se incluyó en el modelo como cofactor para eliminar efectos confusores. Los resultados de este estudio indicaron que la fase del ciclo estral no afectaba al número ni la calidad de ovocitos recuperados. Así mismo, la aptitud productiva tampoco ejerció influencia alguna en la producción de ovocitos, ni su interacción con las fases del ciclo estral. El ensayo 3 fue desarrollado para conocer la influencia de la edad y de la fase del ciclo estral de los animales sobre la recuperación de ovocitos, para lo cual se utilizaron los datos proporcionados por el Servicio Veterinario Oficial del matadero, agrupándose a los donantes en dos grupos: de 7-12 meses (novillas) y ¿24 meses (adultas)). Este estudio fue realizado exclusivamente en animales de razas cárnicas, ya que, en el matadero en el que se realizó el estudio no se sacrificaban hembras jóvenes de aptitud láctea. Para este ensayo fueron pesados 109 pares de ovarios, y mediante la técnica de slicing se recuperaron 3100 ovocitos, para luego ser clasificados en las distintas categorías. El número total de ovocitos recuperados fue mayor en novillas que en adultas con 29,3 vs 25,0 respectivamente, sin embargo no se apreciaron diferencias si sólo considerábamos los ovocitos de categoría superior. La fase del ciclo estral y sus interacciones no influyeron en el número y la calidad de los ovocitos recuperados. El objetivo del ensayo 4 fue relacionar el diámetro del ovocito con la edad de las donantes de ovarios. La recogida de ovarios fue realizada sistemáticamente una vez por semana durante los meses de marzo y abril 2012. Se recolectaron ovarios con el mismo procedimiento del tercer ensayo. Una vez clasificado los ovocitos se escogieron al azar 20 unidades para novillas y 30 para adultas y, a continuación, se midió el diámetro mediante un microscopio provisto de ocular graduado. En todas las categorías (A, B, C, D y E) el diámetro de los ovocitos en vacas adultas era superior a los de novillas, siendo en promedio 139,1µm y 129,5µm respectivamente. A modo de resumen global de los cuatro ensayos, a la hora de elegir ovarios procedentes del matadero sería más eficiente: elegir aquellos de mayores dimensiones (peso), puesto que se obtienen mayores rendimientos en cantidad y calidad de ovocitos. No es necesario tener en cuenta ni la fase del ciclo estral ni la aptitud productiva de las donantes puesto que no influyen en la recuperación de ovocitos. Por otro lado sería recomendable realizar la técnica slicing ya que resultó ser más eficiente que la técnica de aspiración. A priori debemos considerar que se pueden emplear hembras jóvenes sacrificadas en matadero como donantes de ovocitos ya que no parece influir en el rendimiento del proceso. Además, a pesar de que el diámetro de los ovocitos recuperados en las hembras jóvenes es inferior al de las vacas adultas, su tamaño es superior a las cifras consideradas como límite para asegurar su competencia. Sin embargo, y a falta de estudios más profundos, parece viable emplear hembras jóvenes en la producción in vitro de embriones bovinos.