Determinación de ATP6V1C1 en muestras de citología exfoliativa de la cavidad oralimplicación en el diagnóstico del carcinoma oral de células escamosas. Un estudio preliminar

Zusammenfassung

Introducción El carcinoma oral de células escamosas (COCE), representa el 95 % de las lesiones malignas de la cavidad oral. La biopsia es la prueba definitiva para el diagnóstico de certeza. Debido a las dificultades técnicas, al carácter cruento y al desarrollo de las técnicas moleculares, ha resurgido el interés de la citología exfoliativa como técnica diagnóstica del COCE. En estudios previos hemos determinado la expresión genética diferencial de dicho tumor, evidenciando la sobreexpresión del gen ATP6V1C1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. ATP6V1C1 es uno de los principales reguladores de las V-ATPasas, máximas responsables del micromedioambiente ácido de los tumores sólidos, implicadas en procesos tan importantes como el fenómeno metastásico y la resistencia a multidrogas (MDR). El objetivo de esta tesis doctoral es determinar mediante una técnica rápida, sencilla e indolora, como la citología exfoliativa, los niveles de expresión de ATP6V1C1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real (PCRq-RT) en muestras citológicas y determinar su implicación en el diagnóstico y el pronóstico del COCE. Material y método Se estudian 16 pacientes con COCE que acuden al Servicio de Cirugía Maxilofacial del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, no tratados previamente. El grupo control está formado por 16 individuos voluntarios sanos. Entre las variables clínicas y demográficas se incluyen la edad, sexo, consumo de tabaco, localización del tumor y estadío tumoral. Se extrae una muestra de citología exfoliativa del tumor y de la mucosa yugal de los controles, con el instrumento Cytobrush®, para estudiar la expresión de ATP6V1C1 mediante PCRq-RT. El diagnóstico de certeza se realiza mediante biopsia, procedimiento habitual en estos pacientes. Se realiza estudio inmunohistoquímico de la expresión de la proteína ATPasa C1, en 8 muestras de COCE y en 2 de mucosa normal adyacente al tumor, para confirmar la expresión del producto del tránscrito en las células epiteliales. El estudio estadístico incluye análisis descriptivo, univariante y pruebas de rendimiento diagnóstico con curvas ROC, mediante estimación de los valores de la sensibilidad, especificidad, accuracy, valores predictivos y razones de verosimilitud. Resultados En cuanto a las variables clínicas y demográficas, la distribución según sexo muestra un mayor número de hombres (75 %) en el grupo de casos, mientras que en el grupo de los controles, existe una mayoría de mujeres (75 %). Estas diferencias son estadísticamente significativas (Chi-cuadrado de Pearson=16,00, p<0,001). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en ninguna de las demás asociaciones estudiadas entre las distintas variables clínicas y demográficas. En cuanto al análisis inmunohistoquímico, en la mucosa oral normal se observa expresión de la subunidad C1 en los estratos basales e intermedios, con ausencia en los estratos superficiales queratinizados. El patrón de expresión es homogéneo y la intensidad leve. Se reconoce expresión en las células del estrato basal, con alguna célula con tinción nuclear, pero la mayoría presenta expresión citoplasmática. Las células positivas subepiteliales corresponden mayoritariamente a células endoteliales y a células histiocitarias. En el COCE se reconoce una expresión más intensa que se dispone especialmente en la periferia de los nidos tumorales con ausencia en las zonas disqueratóticas. A mayor aumento se observa que la expresión en las células tumorales es principalmente citoplasmática. Todos los carcinomas presentaron tinción citoplasmática, en tres se reconocía expresión perinuclear y en dos nuclear. En relación con la intensidad, la expresión era leve en tres y moderada en los otros cinco. No hemos reconocido diferencias en relación con la diferenciación. En cuanto a la expresión de ATP6V1C1, en el grupo caso es de 12,14 ± 12,88, con un rango de 0,46-56,01. Por su parte, en el grupo control, la expresión de ATP6V1C1 es de 0,33 ± 1,3, con un rango de 0-6,77. Estas diferencias son estadísticamente significativas (U de Mann Whitney=26, p<0,001). Los niveles de expresión de ATP6V1C1 según los diferentes estadíos tumorales, presentan un gradiente con niveles crecientes a medida que se incrementa el estadío. No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de ATP6V1C1 y el sexo, la localización ni el hábito tabáquico. Si establecemos un modelo de regresión teniendo en cuenta la expresión de ATP6V1C1, el área bajo la curva (AUC) es de 0,9746 y el valor de los índices diagnósticos, añadiendo al modelo basal (expresión de ATP6V1C1) el consumo de tabaco es: sensibilidad= 81,25 %, especificidad= 93,75 %, accuracy 87,50 %, valor predictivo positivo= 92,86 %, valor predictivo negativo 83,33 %, razón de verosimilitud positiva= 13 y razón de verosimilitud negativa= 0,06. Conclusiones y perspectivas Se confirma la sobreexpresión del gen ATP6V1C1 en el COCE, de una manera estadísticamente significativa con respecto a los controles sanos, mediante PCR-qRT, en muestras obtenidas mediante citología exfoliativa. Existe una relación estadísticamente significativa y con gradiente de incrementación, entre los niveles de expresión de ATP6V1C1 y el estadío tumoral. El análisis mediante curvas ROC, indica que la determinación de los niveles de expresión de ATP6V1C1, constituye un método diagnóstico altamente sensible y específico, para la discriminación entre muestras de COCE y de mucosa oral normal. Con las limitaciones derivadas de un estudio preliminar, este trabajo constituye una base fundamental y necesaria, para poder determinar la eficacia de la determinación de los niveles de ATP6V1C1, en el diagnóstico precoz del COCE, a través de la identificación de lesiones precancerosas, así como la posibilidad de minimizar los fenómenos metastásicos y la MDR, mediante inhibidores específicos de las V-ATPasas.