Degradation of pharmaceutical compounds by ligninolytic fungi

Resumo

Resumen general Los compuestos farmacéuticos se utilizan ampliamente a nivel mundial con fines terapéuticos y de mejora de calidad de vida en el ámbito de salud humana y animal. Existe un gran número de grupos terapéuticos aplicados para el tratamiento de distintas enfermedades o dolencias: antibióticos, analgésicos, anti-inflamatorios, anticonceptivos, antidepresivos, antineoplásicos, antiepilépticos, anticonvulsivos, compuestos beta-bloqueantes, reguladores lipídicos, medios de contraste para rayos X, tranquilizantes, entre otros. Se ha calculado que el consumo a nivel mundial de este tipo de compuestos supera las 1000 toneladas por año. El consumo de cada grupo terapéutico puede variar dependiendo de si la venta se encuentra restringida a prescripción médica, tal es el caso de los antidepresivos, o bien pueden comprarse libremente, tal es el caso de los anti-inflamatorios. Tras su consumo y/o uso, estos compuestos se liberan al ambiente a través de la orina y heces fecales ya sea en su forma original o bien en forma de metabolitos y productos de degradación. Posteriormente, pueden ser transportados a través del sistema de alcantarillado municipal, distribuyéndose en aguas superficiales o bien en aguas subterráneas, en concentraciones variables desde ng/L hasta ¿g/L. Su presencia en el medio acuático se debe, en gran medida, al hecho de que los tratamientos convencionales de las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs) no los eliminan de forma eficaz. Por ello, el agua residual municipal representa la fuente de emisión de compuestos farmacéuticos más relevante. Por el contrario, estos compuestos se pueden detectar en agua potable, si bien existen evidencias de la presencia de algunos de estos compuestos en concentraciones muy bajas, del orden de ng/L, en este medio. Estos compuestos pueden generar problemas de ecotoxicidad sobre los organismos acuáticos y terrestres debido a sus propiedades fisicoquímicas, su distribución y persistencia, pero principalmente debido al hecho de que estos compuestos han sido diseñados para producir efectos biológicos en los seres vivos incluso en concentraciones bajas. Por ello, existe un riesgo potencial a su exposición, ya que pueden afectar organismos en diversas formas (cambios de sexo en organismos superiores, modificaciones de crecimiento en plantas, deformidades anatómicas, entre otros). Los fármacos son capaces de persistir en el ambiente durante períodos prolongados ya sea en su forma original o como sus productos de degradación, dependiendo de su estructura química así como de sus propiedades fisicoquímicas. Es importante conocer los parámetros característicos de cada uno de ellos para determinar los métodos óptimos para su eliminación eficaz. Las principales propiedades fisicoquímicas a tener en cuenta Resumen general 2 que se encuentran potencialmente relacionadas con los mecanismos de eliminación de estos compuestos son: (i) la solubilidad (S), que a su vez dependerá del pH ambiental, presencia de sales y/o metales, temperatura; (ii) el coeficiente de Henry (H), indicador de su volatilidad; (iii) la constante de disociación (pKa), que indica la tendencia que tiene cada compuesto para disociarse; (iv) el coeficiente de partición octanol-agua (Kow), que indica el carácter lipofílico de cada compuesto; (v) el coeficiente de distribución sólido-agua (Kd), que se relaciona con la concentración del compuesto que se encuentra en la fase sólida o líquida; (vi) finalmente la constante de degradación de pseudo-primer orden (Kbiol), que indica la facilidad de biodegradación que presenta un determinado compuesto en condiciones aeróbicas mediante lodos biológicos. En los últimos años se han estudiado e implementado diversos métodos fisicoquímicos y biológicos para eliminar estos compuestos en las EDARs así como en el ambiente acuático. Algunos métodos como procesos de coagulación-floculación, flotación, nitrificación-desnitrificación, biorreactores de membrana (MBRs) han demostrado altas eficiencias de eliminación de compuestos farmacéuticos, especialmente aquellos considerados en esta tesis doctoral. Sin embargo, algunos compuestos recalcitrantes tales como fluoxetina, carbamazepina y diazepam requieren procesos avanzados de oxidación (AOPs) para conseguir su eliminación completa. A pesar de la alta eficiencia de estos métodos, la principal desventaja es su elevado coste comparado con el resto de los procesos mencionados. Una alternativa para la eliminación de fármacos podría ser el uso de hongos ligninolíticos de podredumbre blanca (WRF). Estos son un grupo de microorganismos capaces de degradar la lignina, uno de los componentes de la madera, con una estructura aromática altamente compleja. Estos hongos secretan enzimas ligninolíticas durante su metabolismo secundario: manganeso peroxidasa (MnP), lignina peroxidasa (LiP), peroxidasa versátil (VP) y Lacasa (Lac), que son responsables de la generación de radicales libres altamente reactivos y con baja especificidad por substrato, lo cual plantea su uso como una alternativa potencial para la eliminación de compuestos altamente biodegradables. En esta tesis doctoral se ha evaluado la degradación de ocho compuestos farmacéuticos pertenecientes a diversos grupos terapéuticos: antibióticos (sulfametoxazol, SMX), antidepresivos (citalopram, CTL; fluoxetina, FLX), anti-inflamatorios (diclofenaco, DCF; ibuprofeno, IBP; naproxeno, NPX), antiepilépticos (carbamazepina, CBZ) y tranquilizantes (diazepam, DZP) por acción de tres cepas de WRF: un hongo anamorfo de Bjerkandera sp. R1, Bjerkandera adusta y Phanerochaete chrysosporium. En la primera parte del capítulo 1 se presenta una revisión bibliográfica acerca de los compuestos farmacéuticos donde se incluyen algunos datos relevantes acerca de su consumo y presencia en aguas. Además se explica brevemente las vías de entrada de Resumen general 3 estos compuestos al ambiente acuático e incluso se plantean los posibles efectos tóxicos que pueden generar estos compuestos tras su liberación al ambiente. Además se hace una breve descripción de los compuestos pertenecientes a los grupos terapéuticos antes mencionados así como los principales mecanismos de eliminación y sus propiedades fisicoquímicas. Finalmente, se incluyen algunos métodos biológicos y fisicoquímicos que han sido investigados de cara a su degradación. En la segunda parte de este capítulo se hace referencia a la importancia que tienen los hongos ligninolíticos así como a las principales características de las enzimas MnP, LiP, VP y Lac para así entender mejor la capacidad de estos organismos y sus enzimas para la eliminación de compuestos recalcitrantes incluyendo los fármacos considerados. Finalmente, se plantean los objetivos principales de esta tesis doctoral. En el capítulo 2 se incluyen los materiales y métodos utilizados. Primeramente, se incluyen las tres cepas de hongos ligninolíticos seleccionadas así como una lista con los compuestos farmacéuticos y los disolventes utilizados. Inicialmente se llevaron a cabo ensayos de inhibición del crecimiento del micelio bajo diferentes concentraciones de mezclas de fármacos para determinar la concentración máxima que estos microorganismos pueden tolerar sin que se vea afectado su crecimiento. También se presentan las condiciones de cultivo en estático, libre en forma de pellets e inmovilizado en espuma de poliuretano, especialmente relevantes en los experimentos en discontinuos; así como la preparación del pre-inóculo para los diferentes tipos de biorreactor. Por ello, se presenta la configuración de los biorreactores empleados: reactores de tanque agitado (RTA) y reactores de lecho fijo (FBR), operados con hongo libre e inmovilizado, así como una breve descripción de los ensayos realizados, incluyendo detalles sobre el sistema de pulsación de oxígeno y la distribución del tiempo de residencia (RTD). Por otra parte, se describen los métodos extraer los compuestos farmacéuticos con acetonitrilo así como los ensayos de adsorción de fármacos sobre la biomasa de los hongos y/o la espuma de poliuretano. Para la identificación y cuantificación de los compuestos analizados se utilizó cromatografía líquida de alta eficacia con un detector de array de diodos (HPLC-DAD) así como cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS). Finalmente se enumeran las técnicas analíticas utilizadas para realizar un seguimiento de los perfiles de fermentación durante los ensayos de degradación. Los primeros experimentos se describen en el capítulo 3 donde se ha estudiado el efecto de diferentes concentraciones de los compuestos farmacéuticos seleccionados sobre el crecimiento del micelio de las tres cepas de WRF cultivadas en placa para determinar la concentración máxima de ensayo. Los resultados de este capítulo permitieron determinar que los hongos pueden crecer sin problemas de inhibición a Resumen general 4 concentraciones sobre 1 mg/L. Adicionalmente se analizó la capacidad de eliminación de los fármacos en ensayos en discontinuo utilizando tres tipos de cultivo diferentes como son los cultivos en estático, con pellets y con hongo inmovilizado en espuma de poliuretano. Los cultivos con pellets presentaron los porcentajes de eliminaciones más altos, más del 99% para DCF, IBP, NPX, CBZ y 57% para DZP. Los ensayos de degradación de fármacos indican que incluso niveles de actividad bajos de enzima pueden ser suficientes para eliminar eficazmente estos compuestos. Estos resultados fueron la base de un experimento posterior realizado en un RTA de 0.75 L, que se aplicó en la degradación de cinco compuestos farmacéuticos diferentes (DCF, IBP, NPX, CBZ, DZP) mediante el hongo anamorfo y P. chrysosporium. Finalmente se llevó a cabo un ensayo de degradación de 24 h así como un experimento en fed-batch con pulsos diarios de farmacos para analizar la eliminación de los tres anti-inflamatorios bajo la acción del anamorfo de Bjerkandera sp. R1. Se determinó un tiempo de residencia hidráulico (HRT) adecuado para eliminar estos compuestos de 24 h o incluso inferior (se logró la eliminación completa de IBP en sólo 4 h). Los compuestos anti-inflamatorios se eliminaron de forma total por ambas cepas en el RTA, mientras que CBZ y DZP se eliminaron parcialmente (desde 15% hasta 55%). El comportamiento de los pellets dentro del reactor varió de una cepa a otra, debido a que el hongo anamorfo presentó un crecimiento excesivo de biomasa. Debido a esto, se descartó la utilización de dicho hongo para posteriores experimentos en fed-batch y continuo en biorreactores con el fin de evitar problemas de compactación y taponamiento del lecho. Para los experimentos posteriores de esta tesis se seleccionó P. chrysosporium. En el capítulo 4 se describen las condiciones de operación en fed-batch y continuo en un RTA con pellets de P. chrysosporium para la eliminación de DCF, IBP, NPX, CBZ y DZP. Uno de los objetivos es evaluar si los reactores en fed-batch o en continuo lograban mantener o incluso superar los porcentajes de degradación obtenidos en experimentos previos. Así, en un primer experimento se estudió el efecto del nivel de oxígeno sobre la degradación de los tres anti-inflamatorios así como el efecto sobre la morfología de los pellets durante una operación fed-batch en el reactor durante 30 días. En un reactor se alimentaron pulsos de oxígeno con diferentes frecuencias mientras que en el otro se aplicó un flujo de aire en continuo. Los resultados obtenidos durante este capítulo demostraron que los niveles altos de oxígeno no tienen un efecto significativo sobre la degradación de los fármacos, ya que los porcentajes de eliminación bajo el flujo de aire en continuo y pulsos de oxígeno fueron similares (>99% para DCF e IBP y más de 77% para NPX). Sin embargo, los pulsos de oxígeno favorecieron el control del crecimiento excesivo de la biomasa mejorando así la operación y estabilidad del RTA durante períodos de tiempo mayores. A pesar de esto, durante los siguientes ensayos se consideró un flujo de Resumen general 5 aire en continuo como sistema de aireación del reactor debido a los menores costes de operación. Posteriormente, se utilizó un RTA con pellets de la cepa seleccionada para eliminar los tres anti-inflamatorios y el antiepiléptico CBZ durante una primera etapa en operación fed-batch (26 días). A continuación, el biorreactor se operó en continuo hasta el día 70. En un experimento adicional, se operó en continuo un RTA durante 50 días para la eliminación de los tres anti-inflamatorios, incluyendo los compuestos recalcitrantes (CBZ y DZP). Así, se demostró que la degradación de los fármacos se favoreció cuando el RTA inició su operación en modo fed-batch durante algunas semanas consiguiendo eliminaciones completas de los tres anti-inflamatorios y significativas de CBZ (hasta un 63%). Cuando el reactor cambió su operación a modo continuo el hongo fue capaz de mantener la degradación parcial o total de estos compuestos durante más de 50 días alcanzando los siguientes porcentajes de eliminación: DCF (34% - 90%); IBP (65% - 95%); NPX (17% - 94%); CBZ (5% - 94%). Los resultados de la operación en continuo demostraron que P. chrysosporium fue capaz de eliminar los anti-inflamatorios pero con tiempos de residencias superiores. Además, se consiguió eliminar un 53% de CBZ, sin embargo no fue posible eliminar DZP. En el capítulo 5 se describen las condiciones de operación en FBRs utilizando P. chrysosporium previamente inmovilizado en espuma de poliuretano para el tratamiento en continuo de DCF, IBP, NPX, CBZ y DZP durante 100 días. Para ello, se estudió el efecto del nivel de oxígeno sobre la degradación de los fármacos así como sobre el control del crecimiento del micelio mediante dos sistemas de aireación: flujo de aire en continuo y pulsos de oxígeno. Los resultados de este experimento demostraron que el hongo inmovilizado fue capaz de eliminar fácilmente los compuestos anti-inflamatorios durante 100 días de operación (78% - 99%), mientras que se consiguió eliminar parcialmente CBZ (hasta el 90%) y DZP (hasta el 72%) bajo ambas condiciones de aireación (aire y oxígeno). Se obtuvieron porcentajes de eliminación más altos para los compuestos recalcitrantes durante la primera mitad de operación (hasta el día 40). Posteriormente, la eficiencia de eliminación disminuyó en ambos reactores. Es importante mencionar que la degradación de DZP se favoreció cuando había niveles altos de oxígeno dentro del biorreactor; mientras que los porcentajes mayores de eliminación de CBZ se lograron bajo flujo de aire en continuo. En un segundo experimento se procedió a analizar la degradación en continuo de estos compuestos farmacéuticos en un RTA con hongo inmovilizado durante 50 días. Este reactor mantuvo una operación estable, sin problemas de taponamiento durante el período establecido alcanzando altos porcentajes de eliminación para los anti-inflamatorios. Sin embargo estos porcentajes fueron menores que los conseguidos en los FBRs. La eliminación de los compuestos recalcitrantes CBZ y DZP también fue menor Resumen general 6 cuando se utilizó el RTA bajo esta configuración: menos del 61% y menos del 40%, respectivamente. En el capítulo 6 se incluye una revisión bibliográfica de los principales productos de degradación de los tres anti-inflamatorios utilizados (DCF, IBP y NPX). Según las referencias previas, los principales productos de degradación de DCF, IBP y NPX son 4-hidroxi-diclofenac, 1-hidroxi-ibuprofeno y 6-O-desmetil-naproxen, respectivamente. Se estudiaron los cromatogramas obtenidos por GC-MS en diversos ensayos de degradación para determinar la presencia de compuestos que pudieran corresponder con sus posibles metabolitos. Para ello, se han estudiado las posibles estructuras de los compuestos originales y sus posibles metabolitos después de sufrir una derivatización. Posteriormente, se evaluaron las posibles rutas de fragmentación de estos compuestos, que deberían estar relacionados con los iones de cuantificación mayoritarios detectados en los cromatogramas obtenidos durante los experimentos. Tras analizar los cromatogramas, se pudo observar la presencia de diversos picos con iones de cuantificación que podrían corresponder con los principales productos de degradación. Sin embargo, no se ha podido identificar inequívocamente ni cuantificar su presencia ya que sería necesario disponer de los compuestos patrón que no están comercialmente disponibles. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral demuestran que los hongos ligninolíticos tienen la capacidad para eliminar eficazmente productos como los anti-inflamatorios, antibióticos y anti-depresivos, mientras que compuestos altamente recalcitrantes como FLX, CBZ y DZP también se eliminaron, aunque de forma parcial. La determinación de los productos de degradación y/o metabolitos es un aspecto de especial relevancia de cara a plantear las posibles rutas de degradación de estos compuestos.