Bases moleculares da hiperplasia suprarrenal conxénita

Zusammenfassung

ANTECEDENTES El término Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) hace referencia a un conjunto de enfermedades de carácter autosómico recesivo que afectan a la síntesis de esteroides suprarrenales y que se caracterizan por un bloqueo total o parcial de la síntesis de cortisol. Este bloqueo puede ir acompañado de un déficit de aldosterona. Como resultado de la deficiencia en la cascada de síntesis de cortisol, se van a producir cambios en la producción de esteroides sexuales, que a su vez, va a afectar al desarrollo sexual primario y secundario de los pacientes desde la etapa fetal a la edad adulta. En el 90-95% de los casos el defecto enzimático responsable de la HSC es el déficit del enzima 21- hidroxilasa (OMIM +201910), una de las enfermedades autosómico recesivas más frecuentes. El enzima 21-hidroxilasa (21OH) es el responsable de metabolizar la progesterona (Prog) y 17- hidroxiprogesterona (17OHP) a 11-desoxicorticosterona (11DOC) y 11-desoxicortisol (S), respectivamente. El déficit severo de 21OH da lugar al fenotipo clásico de la enfermedad y afecta a 1 de cada 10.000-23.000 nacimientos. Esta forma clásica de déficit de 21OH se divide, a su vez, en la forma de pérdida salina, caracterizada por el déficit de cortisol y de aldosterona, y en la forma virilizante simple, resultado de una actividad enzimática residual insuficiente para la síntesis de cortisol, pero que garantiza una síntesis normal de aldosterona. Un déficit parcial del enzima da lugar al fenotipo de forma no-clásica de déficit de 21OH. Esta forma leve de la enfermedad es mucho más frecuente y afecta a 1 de cada 100-500 individuos en la mayoría de las poblaciones. La segunda causa más común de HSC es el déficit de 11-hidroxilasa (OMIM +202010), que representa entre el 5-8% de los pacientes afectos de HSC. El enzima 11-hidroxilasa (11OH) convierte la 11DOC y el S a corticosterona y cortisol, respectivamente. Al igual que para el déficit de 21OH, se ha descrito un fenotipo clásico de déficit de 11OH, asociado a un déficit severo de la actividad 11OH, que se diagnostica en 1 de cada 100.000-200.000 individuos. También se ha descrito una forma noclásica de déficit de 11OH, aunque se supone que es poco frecuente. PRESENTACIÓN CLÍNICA Las manifestaciones clínicas en los pacientes afectos de forma clásica de HSC derivados del exceso de andrógenos son la virilización de genitales femeninos externos durante la etapa fetal, crecimiento acelerado, edad ósea adelantada, que da lugar al cierre de epífisis prematuro y talla baja. Otros síntomas son el desarrollo precoz de vello pubiano, axilar y facial. La exposición continuada a niveles de esteroides sexuales elevados puede dar lugar a pseudopubertad precoz. En la edad adulta, este exceso de andrógenos se asocia con amenorrea, oligomenorrea, tumores testiculares e infertilidad masculina y femenina. Es importante señalar que existe una importante variabilidad interindividual en el desarrollo de signos de exceso androgénico pre y postnatal, posiblemente atribuibles a variaciones en los niveles de precursores secretados por las glándulas adrenales o a la eficiencia de la conversión de estos precursores a andrógenos más potentes. Un signo muy común en los pacientes afectos de forma clásica de HSC por déficit de 11OH es la hipertensión, debido al efecto mineralocorticoide de la 11DOC. El bloqueo en la síntesis de aldosterona va a dar lugar a la aparición de crisis de pérdida salina en los recién nacidos afectos de la forma clásica de déficit de 21OH durante las primeras 4 semanas de vida, que cursa con hiponatremia, hipocalemia, hiperreninemia y choque hipovolémico. Estas crisis pueden ser fatales si no se administran mineralocorticoides, glucocorticoides y se hace una reposición hidrosalina. Los pacientes afectos de forma no-clásica de HSC sintetizan cantidades normales de cortisol y aldosterona, pero producen un exceso de esteroides sexuales. La presentación clínica es muy variable, desde pacientes asintomáticos a pacientes con signos severos de hiperandrogenismo postnatal. Los signos más característicos durante la infancia son pubarquia prematura, acné severo, crecimiento acelerado y edad ósea adelantada. En la edad adulta, las manifestaciones clínicas derivadas del efecto hiperandrogénico son más evidentes en mujeres que en hombres, siendo estos últimos muchas veces asintomáticos. En el caso de las mujeres adultas afectas de forma no-clásica, los síntomas más frecuentes son hirsutismo, oligomenorrea y acné severo. Aunque se trata de una enfermedad recesiva, son varios los trabajos que describen signos y síntomas de hiperandrogenismo en individuos portadores de déficit de 21OH. Sin embargo, estudios caso-control no han confirmado estos hallazgos, y además, no todos los portadores de la enfermedad son sintomáticos. GENÉTICA MOLECULAR Enzima 21-hidroxilasa El enzima 21-hidroxilasa es un enzima de la familia del citocromo P450. La variante silvestre tiene 494 amino ácidos, aunque también se ha descrito una variante funcional con 495 residuos, y un peso molecular de 52 kDa aproximadamente. El enzima está codificado por el gen CYP21A2, localizado en el Complejo Mayor de Histocompatibilidad, en el cromosoma 6 (6p21.3). Aproximadamente a 30 Kb del gen CYP21A2 se encuentra el pseudogén CYP21A1P. Ambos, gen y pseudogén, contienen 10 exones y comparten una homología del 98% en la región codificante, y del 96% en la región intrónica. El gen CYP21A2 y el pseudogén CYP21A1P se localizan en el denominado módulo RCCX. Este módulo es una región cromosómica de unas 30 kb altamente variable y constituido por 4 genes o pseudogénes: RP1/2-C4A/B-CYP21A1P/CYP21A2-TNXA/B. La mayoría de los cromosomas tienen 2 módulos RCCX, aunque también se han descrito ordenamientos monomodulares, trimodulares o incluso cuatrimodulares. La elevada homología existente entre el gen CYP21A2 y el pseudogén CYP21A1P, así como la existente entre los módulos RCCX favorece los procesos de recombinación génica. Aproximadamente el 75% de las mutaciones asociadas al déficit de 21OH son mutaciones puntuales, total o parcialmente deletéreas, que están presentes en el pseudogén y que aparecen en el gen CYP21A2 por conversiones génicas. Alrededor de un 20% de los alelos deletéreos se originan por entrecruzamiento desigual que tienen como resultado la deleción del gen o la formación de genes quiméricos CYP21A1P/CYP21A2. Se asume que el 5% restante son mutaciones que no son el resultado de recombinaciones genéticas, ya que no se han encontrado en el pseudogén. Aproximadamente el 1-2% de los alelos mutados se originan de novo. Se ha postulado que deleciones o duplicaciones del módulo RCCX, podrían estar actuando como premutaciones, que aumentan el riesgo de que ocurra una mutación de novo, ya que facilitaría un emparejamiento intercromosómico desigual. A este emparejamiento desigual, que ocurriría en el 50% de las meiosis entre cromosomas con un número diferente de módulos RCCX, se le ha atribuido el origen de la mayoría de las mutaciones patológicas encontradas en el gen CYP21A2. Enzima 11-hidroxilasa En humanos, existen dos isenzimas CYP11B, que son el enzima 11-hidroxilasa (CYP11B1) y el enzima aldosterona sintetasa (CYP11B2), que sintetizan cortisol y aldosterona, respectivamente. Ambas proteínas, en su estado maduro, contienen 479 amino ácidos, tras la eliminación del péptido señal, que les confiere un peso molecular de 51 kDa y 49 kDa, respectivamente. El enzima 11-hidroxilasa está codificada por el gen CYP11B1, localizado en el cromosoma 8 (8q21), aproximadamente a 40 kb del gen que codifica para el enzima CYP11B2 (CYP11B2). Cada gen contiene 9 exones y comparten una homología del 95% en la región exónica y del 90% en la región no codificante. Al igual que ocurría con el gen CYP21A2 y su pseudogén CYP21A1P, los genes CYP11B1 y CYP11B2 son altamente homólogos, sin embargo, en este último caso, ambos genes son activos. Es por esto que aunque pueden ocurrir entrecruzamientos desiguales o conversiones génicas entre ambos genes, no son mecanismos importantes en la generación de mutaciones deletéreas. Aunque en un principio se pensó que las mutaciones asociadas al déficit de 11OH estaban agrupadas en los exones 2, 6, 7 y 8 del gen CYP11B1, el mayor número de mutaciones descritas para este gen ha demostrado que las más de 65 mutaciones conocidas se distribuyen a lo largo de todo el gen. La mayoría de las mutaciones asociadas al déficit de 11OH se originan por transiciones CpG a TpG, que es el tipo más frecuente de mutaciones puntuales en humanos. Se han descrito la presencia de puntos calientes en distintos codones del gen, para los que se han encontrado diferentes cambios nucleotídicos. CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO La HSC es una enfermedad autosómico recesiva, por lo tanto, el fenotipo de los pacientes está determinado por la mutación menos severa. Los individuos que son homocigotos o heterocigotos compuestos para dos mutaciones severas presentarán el fenotipo de forma clásica, y los que son homocigotos para dos mutaciones leves o heterocigotos compuestos para una mutación leve y otra severa, desarrollarán el fenotipo de forma no-clásica. La presencia de más de una mutación en un mismo alelo tiene un efecto sinérgico, de forma que la presencia de dos mutaciones leves en un mismo gen va a hacer que se comporten como una mutación severa. De forma general la correlación genotipo-fenotipo es buena, especialmente para las formas más severas y más leves de HSC. Sin embargo, se han encontrado diferencias en la edad de aparición de síntomas, la edad de diagnóstico, los parámetros bioquímicos, la presencia de crisis de pérdida salina, el grado de virilización o la expresión de hipertensión entre individuos portadores de las mismas mutaciones. En base a las diversidad fenotípica encontrada, la variabilidad en la expresión clínica debe estar condicionada por otros factores, además de la heterogeneidad genética en los loci CYP21A2 o CYP11B1. Estos factores podrían ser diferencias interindividuales en la biosíntesis y sensibilidad a andrógenos, rutas biosintéticas extra-adrenales, variabilidad interindividual en los niveles de 17OHP, 11DOC... . DIAGNÓSTICO PRENATAL La buena correlación genotipo-fenotipo que existe de forma general en los pacientes afectos de HSC hace posible el diagnóstico prenatal basado en el análisis directo del gen asociado a la enfermedad. Para este análisis se utiliza el material genético extraído de vellosidades coriónicas o de líquido amniótico, que se extraen entre las semanas 9-11 y 15-18 de gestación, respectivamente. Debido a que la manipulación de vellosidades coriales es muy laboriosa y delicada, la muestra más empleada es el líquido amniótico. El protocolo establecido para el diagnóstico y tratamiento prenatal consiste en la iniciación de un tratamiento con dexametasona en aquellas mujeres embarazadas que tengan riesgo de tener una hija afecta de forma clásica de HSC. Se ha demostrado, que cuando el tratamiento con dexamentasona se realiza correctamente y se empieza antes de la semana 10 de gestación, es eficaz en la prevención de la virilización de los genitales externos femeninos de fetos afectos. En cuanto es posible la obtención de material genético se hace un cariotipo para determinar el sexo del feto y el estudio genético del gen que corresponda. El tratamiento con dexametasona solamente se continúa en el caso de que el feto sea una niña afecta de forma clásica de HSC. Aunque el tratamiento con dexametasona ha demostrado ser eficaz en la prevención de virilización de genitales externos de las niñas afectas de forma clásica de HSC, su empleo genera controvesia, ya que en algunos casos las madres han desarrollado signos y síntomas de Síndrome de Cushing, y se han descrito algunos casos de retraso en el desarrollo psicomotor en algunos niños tratados. El reciente descubrimiento de ADN fetal en suero y plasma materno ha brindado la posibilidad de determinar el sexo fetal mediante técnicas no invasivas en la semana 7 de gestación. El uso de estas nuevas técnicas permitiría iniciar el tratamiento sólo en aquellos casos en los que se necesita, es decir, cuando el feto sea una niña afecta de forma clásica de HSC. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los objetivos de esta tesis han sido estudiar la frecuencia y distribución de mutaciones comunes y raras asociadas al déficit de 21OH en una muestra de pacientes y en individuos de población general española. El segundo objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar un nuevo método que permitiese la determinación del número de copias del gen CYP21A2 de forma rápida y eficaz. Finalmente, se ha realizado un estudio funcional de las nuevas variantes encontradas en los genes CYP21A2 y CYP11B1 entre los individuos afectos y de población general. De los 138 pacientes afectos de déficit de 21OH estudiados, 122 eran afectos de forma no-clásica y 16 eran afectos de forma clásica. La mayoría de los pacientes afectos de forma no-clásica eran mujeres, hecho que no es sorprendente, ya que ya se ha descrito que los signos y síntomas de hiperandrogenismo son menos evidentes en varones adultos. Se realizó un estudio de progenitores en 78 familias, y en ninguno de estos casos se encontraron mutaciones de novo. La mutación causante de la enfermedad se detectó en ambos cromosomas en todos los individuos afectos de forma clásica, y en 112 de los 122 pacientes afectos de forma no-clásica. La correlación genotipo-fenotipo en nuestra serie de pacientes ha sido buena, a excepción de los 10 pacientes afectos de una forma no-clásica leve en los que sólo se encontró un alelo mutado junto con una copia funcional del gen en el otro cromosoma. El 90% de estos pacientes eran portadores de la mutación p.Val281Leu, lo que sugiere que esta mutación es responsable de la sintomatología de estos pacientes. Anteriormente ya se había descrito un efecto dominante negativo para esta mutación cuando se coexpresa con la variante funcional del enzima 21OH. Además, signos y síntomas de hiperandrogenismo también se han descrito en pacientes portadores de déficit de 21OH, especialmente cuando los pacientes son portadores de la mutación p.Val281Leu. Otra posible explicación del fenotipo de estos portadores sería la presencia de mutaciones fuera de la región estudiada del gen. El genotipado realizado en una serie de 144 individuos de población general española permitió confirmar la alta variabilidad genética previamente descrita para el locus CYP21A2. Hemos encontrado más de 79 variaciones nucleotídicas diferentes, de las cuales, 20 pueden ser consideradas polimorfismos, ya que la frecuencia del alelo minoritario es superior a 0.01. La variabilidad encontrada en este locus no sólo hace referencia a variaciones nucleotídicas, sino también a variaciones en el número de copias del gen CYP21A2. Hasta el momento, variaciones en el número de copias de este gen, debidas a duplicaciones habían sido consideradas como eventos poco frecuentes. Sin embargo, el 7% de los individuos genotipados eran portadores de una duplicación de este gen. La mayoría de estos individuos (90%) eran portadores de la mutación p.Gln318X. La amplificación y secuenciación específica de cada uno de los genes presentes en estos alelos portadores de la duplicación del gen, permitió determinar que estos alelos son funcionales, ya que tienen una copia mutada y otra copia funcional del gen, que neutralizaría el efecto patológico de la mutación. El gen con la mutación p.Gln318X es el que se localiza en la región 3' del gen TNXB, por lo que los métodos de diagnóstico molecular basados en la amplifiación y secuenciación específica del gen CYP21A2 localizado en la región 3' del gen TNXB no detectarían la presencia del gen funcional y diagnosticarían estos alelos como patológicos, cuando en realidad son funcionales. El espectro mutacional encontrado entre nuestros pacientes y en los individuos de población general es muy amplio e incluye 31 alelos mutados diferentes, de entre los cuales, 18 son mutaciones puntuales, la deleción de 8 pares de bases del exón 3 (p.Gly110ValfsX21), el grupo de tres mutaciones del exón 6 (p.Ile236Asn, p.Val237Glu y p.Met239Lys), 9 alelos con más de una mutación, una duplicación de 21 nucleótidos en el exón 10, y una duplicación del gen CYP21A2 con ambas copias del gen portadoras de una mutación severa. En base a la frecuencia de mutaciones encontrada en los individuos de población general, y aplicando el equilibrio de Hardy-Weinberg, se estima que la incidencia de la forma clásica de déficit de 21OH en nuestra población es de 1 de cada 21,000 nacimientos, y para la forma no-clásica, la incidencia estimada es de 1 de cada 200 nacimientos. Las mutaciones más frecuentes entre los pacientes afectos de forma clásica de déficit de 21OH han sido la c.293-13A/C>G (19%) y la p.Gln318X (16%) y mutaciones descritas como raras, que en este grupo de pacientes representan el 22% de los alelos deletéreos. La elevada frecuencia de alelos raros en este grupo de pacientes es debido al efecto fundador de la mutación p.Arg444X. Es importante resaltar la importancia de la secuenciación completa del gen como herramienta básica para el diagnóstico molecular del déficit de 21OH, ya que el uso de otras estrategias basadas en el genotipado de las mutaciones puntuales más frecuentes no detectaría el 22% de las mutaciones severas encontradas en este grupo de pacientes. La frecuencia de deleciones y conversiones del gen encontrada entre la población afecta y los individuos de población general estudiados es baja (9% y 0.35%, respectivamente), comparada con otras poblaciones europeas, o incluso con otras series españolas, y con otros estudios de genotipado de población general. La mutación p.Val281Leu ha sido la más frecuente entre los pacientes afectos de forma no-clásica de déficit de 21OH y en los individuos de población española estudiados (72% y 5.5%, respectivamente). Esta frecuencia es superior a la descrita en otros estudios de población afecta española (56.7%) y en estudios de genotipado de población general (1-2%). La frecuencia de alelos raros, no originados por conversiones con el pseudogén CYP21A1P, está dentro del rango del 5-10% descrito para este tipo de eventos. Las diferencias en la distribución de las mutaciones asociadas al déficit de 21OH encontrada en nuestros pacientes cuando se compara con otras poblaciones o incluso con otras series de pacientes españoles, podría estar reflejando el hecho de que la población gallega es una población europea relativamente aislada. De hecho, ya se había sugerido anteriormente que podía existir una distribución local de alelos asociados a esta patología en la población española, y en otras poblaciones. El conocer la distribución de las mutaciones más frecuentes es especialmente importante cuando el diagnóstico molecular del déficit de 21OH se realiza mediante el genotipado de las mutaciones más comunes. Hemos encontrado 13 nuevas variantes genéticas en el gen CYP21A2. Seis de ellas encontradas en pacientes afectos de déficit de 21OH, dos en individuos con sospecha de déficit de 21OH, dos en pacientes que consultaban por consejo genético y 3 en individuos de población general. El efecto deletéreo de las mutaciones p.Ile46HisfsX33, p.Arg444X, p.Pro463Leu y p.Met473_Arg479dup se pudo inferir a partir del fenotipo de los pacientes, ya que todos ellos eran afectos de forma clásica de déficit de 21OH y tenían otra mutación severa en el otro alelo. Para la determinación del efecto inocuo o deletéreo de las demás variantes genéticas encontradas en este locus se realizaron estudios funcionales utilizando un sistema de co-expresión en levaduras S.cerevisiae. De acuerdo con los resultados de estos estudios funcionales se pudo concluir que la variante p.Trp302Ser es una mutación severa. A pesar de que es una mutación severa, permite una pequeña actividad enzimática residual suficiente para evitar crisis de pérdida salina, y por lo tanto se asocia con la forma virilizante simple del déficit de 21OH, cuando se encuentra en homocigosis o heterocigosis compuesta con otra mutación severa. Las mutaciones p.Asp322Gly, p.His310Asn, p.Thr443Asn son mutaciones leves asociadas con la forma no-clásica de la enfermedad, cuando se encuentran en homocigosis o heterocigosis compuesta con otras mutaciones leves o severas. Finalmente, con estos estudios funcionales se pudo concluir que las variantes p.Trp22Cys, p.Asp184Asn, p.Leu198Phe, p.Ala265Val y p.Val305Gly son variaciones genéticas raras e inocuas para la actividad normal del enzima 21OH. Las variantes p.Leu198Phe y p.Val305Gly se encontraron en los dos individuos que consultaron por consejo genético. La caracterización funcional de ambas variantes permitió concluir que no eran portadores del déficit de 21OH. El estudio genético realizado en 8 pacientes diagnosticados o con sospecha diagnótica de déficit de 11OH, permitió encontrar 7 nuevas variantes genéticas en el gen CYP11B1. Las variantes p.Trp116Gly, p.Ala165Asp y p.Lys254_Ala257del se encontraron en tres pacientes afectos de forma clásica de déficit de 11OH. Las variantes p.Met88Ile y p.Pro159Leu se encontraron en dos pacientes diagnosticados de forma no-clásica de déficit de 11OH. Adicionalmente, la mutación p.Pro159Leu se encontró en heterocigosis en un paciente que consultaba por signos y síntomas de hiperandrogenismo, y que tenía un gen funcional en el otro cromosoma. Las variantes p.Arg366Cys y p.Thr401Ala se encontraron en dos pacientes que también consultaban por signos y síntomas de hiperandrogenismo y que tenían una copia funcional del gen en el otro cromosoma. El estudio funcional basado en la transfección transitoria de las variantes mutadas y silvestre en células COS7 permitió determinar que las 3 mutaciones encontradas en pacientes afectos de forma clásica de déficit de 11OH, p.Trp116Gly, p.Ala165Asp y p.Lys254_Ala257del, son mutaciones que anulan totalmente la actividad del enzima 11OH, y por lo tanto asociadas a la forma clásica de déficit de 11OH cuando se encuentran en homocigosis o heterocigosis compuesta con otra mutación severa. Las mutaciones p.Met88Ile, p.Pro159Leu, p.Arg366Cys y p.Thr401Ala son mutaciones leves, que inactivan parcialmente el enzima 11OH, asociadas a la forma no-clásica del déficit de 11OH cuando el gen del otro cromosoma es portador de una mutación leve o severa. Los resultados obtenidos en esta serie de pacientes parece indicar que, al igual que ocurre con algunos portadores del déficit de 21OH, el estado de portador del déficit de 11OH puede asociarse a signos y síntomas de hiperandrogenismo en ciertos individuos predispuestos. El presente estudio nos ha permitido conocer cuáles son las mutaciones más frecuentes asociadas al déficit de 21OH en nuestra población. El estudio de población general ha confirmado la elevada variabilidad genética descrita para el gen CYP21A2. Hemos encontrado una elevada frecuencia de portadores de duplicaciones del gen CYP21A2, en las que una copia del gen es portadora de una mutación severa y la otra es funcional. La detección de estas duplicaciones es especialmente importante, para evitar diagnosticar estos ordenamientos como patológicos cuando en realidad son alelos funcionales. Además, es importante tener en cuenta, que estas variaciones en el número de copias del gen CYP21A2 podrían aumentar el riesgo de formación de mutaciones de novo, al favorecer un emparejamiento desigual entre cromosomas con diferentes números de copias del gen. Hemos encontrado un elevado número de variantes no descritas previamente en los genes CYP21A2 y CYP11B1. Los estudios funcionales realizados nos han permitido determinar la inocuidad o patogenicidad de las nuevas variantes encontradas. Esta información es de especial interés en el estudio de portadores, diagnóstico prenatal y consejo genético, ya que nos va a permitir inferir el fenotipo de los pacientes portadores de estas nuevas variantes.