Aplicación de técnicas biotecnológicas a la conservación de germoplasma de especies de interés conservacionista"Splachnum ampullaceum" Hedw. y "Centaurea ultreiae" Silva Pando

Resumo

Uno de los briófitos que presenta mayor riesgo de extinción en Europa es el musgo Splachnum ampullaceum Hedw. En Galicia, su situación es más crítica debido a que existen pocas turberas y a la fuerte acción competidora de las especies invasoras. Por otro lado, Centaurea ultreiae Silva Pando (Compositae), es una especie endémica de la provincia de A Coruña de la que sólo se conoce la existencia de una población. El grave deterioro de su hábitat y los cambios en el manejo del monte junto con las nuevas prácticas agrícolas son las principales causas que están ocasionando el declive poblacional de Centaurea ultreiae. Con este proyecto de Tesis Doctoral se aborda la validez y utilidad de las técnicas biotecnológicas para la conservación del germoplasma de ambas especies. El estudio de la conservación ex situ de S. ampullaceum estuvo enfocado tanto a su propagación como a su preservación a medio y largo plazo. Se elaboró un protocolo efectivo de micropropagación de esta especie estudiando sus requerimientos nutritivos. Por primera vez en una especie de la familia Splachnaceae se consiguió observar y describir la formación de propágulos de resistencia conocidos como brood cells y también de bulbillos cloronemáticos. En cuanto a la conservación ex situ del germoplasma de S. ampullaceum desarrollamos un primer método aplicado para medio-largo plazo con el empleo de técnicas de encapsulación en alginato cálcico con el que se consiguieron tasas de recuperación del 100% al año y del 50% tras dos años y medio de almacenamiento en frío a 4ºC. Y un segundo método que se empleó por primera vez en un briófito para su conservación a largo plazo, fue la criopreservación a -196ºC a través de técnicas de vitrificación empleando una solución de vitrificación (PVS). La desigualdad de las fructificaciones de C. ultreiae, la rápida pérdida de viabilidad de sus aquenios a temperatura ambiente, la elevada incidencia de enfermedades ocasionadas por patógenos fúngicos y la escasa capacidad germinativa mostrada mediante metodologías convencionales, hicieron necesaria la aplicación de técnicas biotecnológicas para preservar su germoplasma. La propagación de C. ultreiae se abordó mediante tres vías alternativas. Por un lado, la inducción de embriogénesis somática a partir de explantos de embriones cigóticos. Otra vía fue la inducción de fenómenos organogénicos (caulogénesis) en dos tipos de explantos, fragmentos foliares y de raíces. Por último, la micropropagación a partir de brotes resultó el método más efectivo. Éste fue el método de propagación seleccionado en cuyas plantas regeneradas se realizaron pruebas de estabilidad genética (RAPDs, estudios citogenéticos y citometría de flujo). No se detectaron cambios ni en el patrón de bandeado en los RAPDs, ni en el nivel de ploidía. También se abordaron metodologías biotecnológicas para la conservación a medio y largo plazo de explantos vegetativos de C. ultreiae. La encapsulación de ápices caulinares en alginato cálcico se reveló como un buen método de conservación a medio plazo con una tasa de recuperación de en torno al 80% al cabo de tres meses de almacenamiento en frío (5±1 ºC). Finalmente, las altas tasas de recuperación obtenidas de los brotes crioconservados mediante el protocolo de vitrificación desarrollado (superiores al 95%) hacen de esta técnica un método eficaz de conservación a largo plazo de germoplasma de C. ultreiae.