Actividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la pared celular de " Arabidopsis thaliana "

Resumo

La pared celular es uno de los componentes más característicos de la célula vegetal, puesto que posee funciones de vital importancia entre las que se encuentra darle forma (Bacic et al, 1988) y posibilitar su crecimiento. Podemos diferenciar las paredes celulares por su composición, pero también por su estado fisiológico (pared celular primaria y pared celular secundaria). Nuestro estudio se centra en la pared celular primaria, que posee capacidad de crecimiento (Cosgrove, 1993b; 1996), y está compuesta fundamentalmente por polisacáridos, pequeñas cantidades de glicoproteínas, fenoles y, en algunos tipos celulares especializados, sustancias tales como la lignina, cutina, suberina o sílice (Fry, 2004). Las hemicelulosas más habituales son los xilanos, el xiloglucano y el glucano mixto. El estudio de las enzimas implicadas en la modificación del xiloglucano y sus efectos sobre la pared celular, es el objetivo de nuestro trabajo. Hay cuatro glicanasas capaces de actuar sobre el xiloglucano y/o sus oligosacaridos (alfa-xilosidasa, alfa-fucosidasa, beta-glucosidasa y beta-galactosidasa) que se encuentran en el apoplasto de Arabidopsis thaliana, y concretamente, nos centramos en las actividades enzimáticas beta-glucosidasa y beta-galactosidasa. Inicialmente se comprobó la presencia, en el apoplasto de plantas de Arabidopsis thaliana, de dichas enzimas, necesarias para degradar los oligosacáridos de xiloglucano. Para ello se incubó una solución de oligosacáridos de xiloglucano, se siguió la reacción y sus productos mediante MALDI-TOF, y a continuación se realizó una búsqueda exhaustiva de las posibles beta-glucosidasas y beta-galactosidasas apoplásticas de Arabidopsis que pudiesen estar involucradas en el metabolismo del xiloglucano y/o de sus oligosacáridos y por lo tanto en la extensión de la pared celular. Se encontraron cuatro posibles beta-glucosidasas de la familia 3 de las glicosil hidrolasas y doce beta-galactosidasas de la familia 35. Esto nos ha permitido, demostrar la existencia en el apoplasto de Arabidopsis de las glicanasas necesarias para la completa degradación del xiloglucano y/o de sus oligosacáridos. Estos resultados forman parte de una publicación (Plant Cell Physiology 47: 55-63) que lleva por título #Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana#. En el caso de las glucosidasas, hemos llevado a cabo un análisis de los promotores, mediante construcciones de fusión de dichas regiones con el gen GUS, lo cual nos ha permitido localizar los lugares de expresión de dichos genes y determinar la mayor o menor expresión de los mismos. Para los dieciséis genes que codifican para las proteínas en estudio (cuatro glucosidasas y doce galactosidasas) hemos obtenido los mutantes knockout correspondientes, y tras ser sometidos a una selección, se ha analizado la estructura del xiloglucano de sus paredes celulares mediante MALDI-TOF. Lo cual nos ha permitido seleccionar los mutantes knockout cuyas paredes celulares presentan una composición oligosacarídica que nos permita establecer una relación entre la composición de su xiloglucano y la afuncionalidad de la encima mutada, además, el apoplasto de estos mutantes se ha incubado con oligosacáridos de xiloglucano y los resultados se han analizado mediante MALDI-TOF, para determinar si la falta de la actividad encimática correspondiente se puede relacionar con los productos obtenidos. Se ha llevado a cabo un estudio de la composición de azúcares en las paredes celulares de algunos mutantes de interés mediante espectrometría de masas, y se ha estudiado su cinética de crecimiento en base al diámetro de su roseta basal. Además se ha hecho un estudio de las alteraciones fenotípicas que presentan los distintos mutantes knockout. Mediante PCR en tiempo real, hemos estudiado la expresión de los cuatro genes que codifican para beta-glucosidasas y los doce que codifican para #-galactosidasas, así determinamos cuales presentaban diferencias de expresión en distintos estadíos de madurez (zonas en crecimiento activo y zonas que ya han cesado su crecimiento).El estudió comprendió expresión en hojas (jóvenes y maduras), tallo (apical y basal), raíces, silicuas y flores. Determinamos los niveles de actividad beta-glucosidasa y beta-galactosidasa en apoplasto y hojas, frente a sustratos comerciales, además de las cantidades de proteína correspondientes, por colorimetría. A parte de sustratos artificiales, que dan actividad relativa, utilizamos posteriormente sustratos naturales, concretamente para las glucosidasas utilizamos el oligosacárido XXXG mientras que para las galactosidasas se utilizaron diferentes oligosacáridos, como XLFG o XLLG, así determinamos la temperatura óptima de dichas encimas, y además obtuvimos niveles de actividad in vivo. En relación a las beta-glucosidasas en estudio, el gen que codifica una de ellas At5g20940, presenta mayores niveles de expresión en zonas jóvenes que en zonas maduras, puesto que las zonas jóvenes están en crecimiento activo la encima codificada por este gen podría estar implicada en la extensión de la pared celular. El estudio de los mutantes knockout de las cuatro glucosidasas objeto de estudio, ha puesto de manifiesto que una de ellas At5g20950 presenta una composición de oligosacáridos muy diferente al silvestre (Columbia 0). Cuando se incuba el apoplasto de dicho mutante frente al oligosacárido XXXG, aparece una ausencia total de actividad glucosidasa, lo cual podría indicar que esta encima es la glucosidasa que lleva a cabo la degradación de dicho oligosacárido. Las regiones de la planta en las que se expresan At5g20940 y 20950 así como los niveles de expresión son los mismos, lo cual podría indicar una estrecha relación entre ambos genes. El mutante knockout At5g209504D que hemos seleccionado, correspondiente al gen At5g20950, presenta un crecimiento alterado, ya que alcanza un tamaño superior al del silvestre, y una velocidad de crecimiento también mayor. En cuanto a las galactosidasas, presentan una gran variabilidad en relación a los niveles de expresión, así, en raíces el gen At4g26140 es el que presenta mayor expresión, los genes At3g52840, At4g26140, At2g28470 y At1g77410 presentan mayor expresión en hojas jóvenes y parte apical del tallo si la comparamos con hojas maduras y parte basal del tallo, esto podría determinar una relación entre estos genes y la capacidad de crecimiento, por otro lado el gen At5g56870 presenta un patrón de expresión opuesto a los anteriores y los genes At3g13750, At5g63810, At1g31740 y At2g16730 se expresan más en la parte apical del tallo y en hojas maduras. El estudio de los mutantes knockout nos ha permitido seleccionar aquellos que presentan mayores alteraciones en su xiloglucano con respecto al silvestre y relacionarlas con variaciones fenotípicas y de crecimiento, pero debido a la gran variabilidad no se ha podido seleccionar una única galactosidasa que actúe sobre el xiloglucano y/o sus oligosacáridos, sino que se supone que son varias conjuntamente las que pueden modificarlo, y por lo tanto serían varias las que estarían implicadas en la extensión de la pared celular.