Aislamiento y caracterización de una fracción de PrPsc resistente a proteinasa K (sPrPsc)estudios estructurales sobre la PrPsc

Resumo

Estudios recientes han revelado la presencia de una fracción no despreciable de PrPSc en tejidos infectados con priones que, en contra del concepto preponderante, se muestra sensible a la digestión con proteinasa K (PK). Este hallazgo tiene importantes implicaciones en el contexto del diagnóstico de las enfermedades priónicas, toda vez que el uso de la PK se halla plenamente extendido por la recurrente necesidad de discernir entre PrPSc y PrPC. Sin embargo, la elucidación de la estructura de la PrPSc resulta esencial para poder comprender aspectos fundamentales de la biología molecular de la PrPSc como el mecanismo molecular que dota al prión de la capacidad de transmisión, aspecto que continúa siendo uno de los principales desafíos en la investigación sobre priones, pero que se ha visto obstaculizado por la insolubilidad y el carácter polimérico de la PrPSc. Por ello, este trabajo se ha centrado en la búsqueda de información estructural a través del estudio de la PrPSc sensible a PK (sPrPSc) con la intención de obtener alguna clave que contribuya al entendimiento de la esencia de los procesos de conversión y agregación de la PrPC que conducen a la infectividad. Inicialmente, se ha logrado aislar una fracción de sPrPSc. Este material se obtuvo por centrifugación diferencial, a velocidad intermedia, a partir de PrPSc purificada de hámster sirio mediante un procedimiento convencional basado en ultracentrifugación en presencia de detergentes. La PrPSc sensible a PK es completamente degradada bajo condiciones estándar (50 ug/ml de proteinasa K a 37 ºC durante 1 hora), siendo además susceptible a la digestión con tripsina. Mediante fraccionamiento por centrifugación en gradiente de sacarosa se observa que la sPrPSc se corresponde con las fracciones de menor tamaño molecular dentro del rango continuo de polímeros que constituyen la PrPSc. La PrPSc sensible a PK manifiesta actividad conversora in vitro, siendo capaz de desencadenar el proceso de amplificación de la PrPSc resistente a proteasa a través del ensayo de PMCA (Protein Misfolding Cyclic Amplification). Más aun, la identidad de esta fracción queda plenamente confirmada al demostrar su elevada capacidad infecciosa in vivo. La proteólisis parcial es una herramienta útil para obtener datos estructurales de proteínas, ya que los enzimas proteolíticos cortan preferentemente en las áreas más expuestas y flexibles de las proteínas, sobre todo cuando se trata de lazos, y apenas cortan en zonas que contienen lámina-beta. Así, la proteólisis parcial de la sPrPSc con tripsina ha permitido identificar regiones parcialmente expuestas y flexibles de la molécula en función de su particular susceptibilidad a la digestión, como las que se sitúan en torno a los residuos R136, R151, K220 y R229. La PrPSc sensible a PK aislada de este modo se ha mostrado como un material competente para resolver aspectos estructurales de la PrPSc, y quizás debería ser una fracción a tener en cuenta en la búsqueda de un test preclínico diseñado para detectar enfermedades priónicas. Paralelamente, este estudio se ha combinado con distintas estrategias que convergen en el análisis estructural de la PrPSc. A tal efecto, la propia PrPSc purificada de cerebros de hámster infectados con las cepas 263K y Drowsy fue igualmente sometida a proteólisis limitada con proteinasa K. Tras detener esta reacción, la PrPSc fue desnaturalizada, reducida y finalmente cortada en la Cys-179 con ácido 2-nitro-5-tiocianatonitrobenzoico (NTCB). Los fragmentos fueron analizados por nanoHPLC-MS y MALDI-TOF. Además de los conocidos puntos de corte en las posiciones 90, 86, 92 para 263K y 86, 90, 92, 98 y 101 para DY, estos datos demuestran claramente la existencia de puntos de corte adicionales en zonas más internas de la molécula, que afectan a las posiciones 117, 119, 135, 139 142 y 154 en ambas cepas. Un análisis similar reveló los mismos puntos de corte para sPrPSc, aunque en proporciones diferentes. Estos resultados, coherentes con los obtenidos con tripsina y sPrPSc, sugieren que además de los 'clásicos' puntos de corte para la PK del extremo amino-terminal, la PrPSc contiene, en su núcleo central, regiones que muestran cierto grado de susceptibilidad a proteasas y que, por lo tanto, pueden corresponderse con subdominios que gozan de cierta flexibilidad estructural, intercalados con tramos de amino ácidos con elevada resistencia a la proteólisis. Estos resultados son compatibles con una estructura constituida por tramos cortos de láminas-beta conectados por lazos y giros. De acuerdo con esta visión de la isoforma infecciosa, los inmunoensayos realizados con anticuerpos que reconocen específicamente estructuras de tipo amiloide han resultado positivos para la PrPSc de las cepas 263K y DY en su estado nativo. Por otra parte, los estudios de microscopía electrónica (TEM y crio-TEM) apoyan firmemente la idea de que la PrPSc exhibe una estructura fibrilar. La solubilidad manifestada por la fracción de sPrPSc, la hace particularmente atractiva para su aplicación en crio-TEM, dado que permite la obtención de muestras vitrificadas de menor grosor indispensables para estudios de tomografía.