Isoformas de la proteína quinasa dependiente de AMPc en el molusco bivalvo Mytilus galloprovincialis. Purificación, caracterización funcional y distribución tisular

Resumo

La proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es una proteína quinasa implicada en la regulación de varios procesos fisiológicos que ocurren de forma específica en moluscos bivalvos, como la adaptación a hipoxia o la contracción de músculos catch. La holoenzima PKA consta de un dímero de subunidades reguladoras (R) y dos subunidades catalíticas (C), es decir tiene una estructura R22C. En este trabajo de Tesis Doctoral se han obtenido los siguientes resultados: 1. Se ha demostrado que las isoformas de subunidad R denominadas Rmyt1 y Rmyt2, identificadas previamente en mejillón, son homólogas, respectivamente, de las subunidades tipo I y tipo II de mamíferos. 2. La isoforma Rmyt2 puede ser fosforilada in vitro por la caseína quinasa 2 (CK2) utilizando GTP como dador de fosfato. Esta fosforilación disminuye significativamente la capacidad de Rmyt2 para inhibir la subunidad C. Por tanto, la fosforilación de Rmyt2 mediada por CK2 podría constituir un mecanismo de activación de la PKA, complementario a la activación alostérica por AMPc. 3. Las isoformas Rmyt1 y Rmyt2 muestran una diferente distribución tisular y/o celular. Así, existen células en las cuales sólo se expresó una de las dos proteínas. En otras poblaciones celulares, en cambio, se detectaron ambas isoformas, pero con una diferente distribución dentro de la célula. En general, Rmyt 1 se observó en todo el citoplasma celular, mientras que Rmyt2 se detectó asociada a la membrana celular o a determinadas estructuras como microvellosidades, cilios o flagelos. 4. Se purificaron parcialmente las dos isoformas de PKA que contienen Rmyt1 y Rmyt2 como subunidad R (es decir, PKAmyt1 y PKAmyt2) y se estudió su activación por nucleótidos cíclicos. Ambas holoenzimas son completamente activadas tanto por AMPc como por GMPc, aunque la afinidad por AMPc es 100 veces superior. Por otra parte, la actividad de PKAmyt2, a diferencia de PKAmyt1, fue especialmente sensible a los cambios de temperatura, especialmente a temperaturas superiores a 15ºC. Dado que esta isoforma se localiza, entre otras células, en los flagelos de los espermatozoides, desempeñando un papel clave en la regulación de su motilidad, es probable que la temperatura del agua de mar pueda jugar un papel importante en el proceso de fecundación afectando a la motilidad de los espermatozoides, una vez que éstos y los ovocitos son liberados al agua de mar en el desove del mejillón. 5. Se identificaron y purificaron varias isoformas de la subunidad C de la PKA, a partir de varios tejidos de mejillón. El análisis mediante espectrometría de masas muestra que existen pequeñas diferencias estructurales entre ellas, y sugiere que todas se generan a partir del mismo gen por procesos de corte y empalme alternativo de diferentes exones. No se observaron diferencias significativas entre las diferentes isoformas de subunidad C en cuanto a los parámetros cinéticos obtenidos utilizando un péptido sintético como sustrato, aunque sí se observaron pequeñas diferencias entre algunas isoformas en cuanto a su capacidad para fosforilar in vitro algunas proteínas presentes en un extracto de manto. Finalmente se identificó una proteína de 230 kDa que co-purifica de forma sistemática con una de las isoformas de subunidad C procedente de músculos catch (isoforma C2). Se trata de una proteína homóloga a la filamina de mamíferos.