Metagenomic study of autochthonous bacterial communities at different marine ecosystems affected by the Prestige's oil spill in Galicia(NW-Spain). Biodegradation potential

Resumo

Los vertidos marinos de fuel a gran escala debidos a accidentes de buques petroleros, han planteado grandes amenazas y causado importantes daños a los ambientes costeros afectando a industrias pesqueras, al turismo y por lo tanto a las economías de los sitios afectados. Las costas del Noroeste de España están junto a una importante ruta para el transporte marítimo. Este alto tráfico hace de las costas gallegas un punto caliente para los derramamientos de petróleo. De hecho, desde el desastre del Polycommander, muchos otros han ocurrido como por ejemplo el Urquiola (1976), el Andros Patria (1978) o el Mar Egeo (1992). Siguiendo esta tendencia, el petrolero Prestige (2002) se hundió frente a las costas gallegas virtiendo cerca de 63.000 toneladas de fuel pesado, lo que le sitúa como el vigésimo mayor accidente ocurrido en el mundo hasta la fecha. El vertido afectó a más de 500 millas de las costas españolas e incluso francesas, provocando un desastre ecológico comparable o aún peor que el del Exxon Valdez. Los componentes del petróleo se clasifican en cuatro fracciones: saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos. La proporción de estos componentes determina las características físicoquímicas del fuel como densidad, toxicidad, viscosidad, etc. La fracción saturada (también alcánica o alifática) son hidrocarburos que no contienen ningún doble enlace, mientras que la aromática son compuestos con uno o más anillos aromáticos (Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs)) que tienen efectos carcinógenos y tóxicos. Por último, las resinas y asfaltenos son macromoléculas muy complejas y de estructura desconocida. Cuando el petróleo se derrama en el mar, se extiende por la superficie del agua y es sujeto a diversas modificaciones que cambian sus componentes con el tiempo y por lo tanto su comportamiento en el medio. Este conjunto de procesos, conocido como weathering, es principalmente debido a la evaporación de las fracciones de bajo peso molecular, a la disolución de los componentes solubles en agua, a la mezcla del fuel con agua de mar, a la oxidación fotoquímica y a la biodegradación microbiana. La susceptibilidad de los hidrocarburos del petróleo a la degradación microbiana está generalmente en el orden siguiente: alcanos lineales > alcanos ramificados > aromáticos de bajo peso molecular > alcanos cíclicos > HAPs de elevado peso molecular > Resinas y Asfaltenos, que se consideran recalcitrantes a la degradación microbiana. El residuo de fuel vertido por el Pretige fue clasificado como un fuel pesado que carecía de las fracciones más lábiles (22% alifáticos, 50% aromáticos, 28% resinas y asfaltenos) (Alzaga et al., 2004; http://csicprestige.iim.csic.es/informes/info01.pdf) y por lo tanto más resistente a los procesos de weathering tales como biodegradación. El petróleo primero llegó a las costas de Galicia que continuaron recibiendo grandes cantidades de fuel durante largos periodos de tiempo. Los métodos mecánicos, que normalmente recuperan no más del 10-15 por ciento del fuel que llega a la costa, fueron en muchos casos no aplicables en la predominantemente rocosa y abrupta Costa da Morte gallega. Afortunadamente, los microorganismos capaces de degradar hidrocarburos y compuestos relacionados del petróleo son ubicuos en habitat marinos y por lo tanto podríamos asumir que el fuel se acabaría dispersando, degradando y desapareciendo de forma natural con el tiempo. Sin embargo, las observaciones previas en sitios fuertemente petroleados, como ocurrió en las costas gallegas, indican que esto es generalmente un proceso lento y los depósitos de petróleo persisten durante muchos años. Definido como: -el acto de agregar materiales a los ambientes contaminados para causar una aceleración del proceso natural de biodegradación-, la biorremediación se ofrece como una buena alternativa para la limpieza del fuel depositado en grandes cantidades tras la catástrofe del Prestige en el supralitoral gallego de la Costa da Morte. Sin embargo, todavía sigue habiendo polémica en torno a la biorremediación puesto que su eficacia es variable entre diferentes aplicaciones. Esta variabilidad depende de la interacción de tres factores: a) Las características ambientales del sitio contaminado. Los niveles de nutrientes, oxígeno, Tª, etc. son factores que tienen influencia sobre la actividad biodegradadora de la microbiota indígena. b) El tipo de petróleo derramado (crudo ligero, fuel pesado, gasolina, etc.). Los combustibles pesados, tales como los que vertieron el Prestige o el Nakhodka, generalmente son pobres en las fracciones más inestables y por lo tanto plantean más problemas a la biodegradación que los crudos ligeros (con un mayor contenido de alcanos). c) El potencial de biodegradación de la población microbiana autóctona del habitat afectado. No hay microorganismo capaz de degradar todos los componentes de una mezcla del petróleo. En condiciones naturales, la biodegradación de un fuel implica normalmente la sucesión de diversas comunidades microbianas capaces de degradar diferentes hidrocarburos. Por lo tanto, para diseñar el biorremedio más apropiado que potencie la tasa natural de biodegradación de la comunidad microbiana autóctona necesitamos tener la mayor información posible sobre dichos consorcios. Saber qué nutrientes, cofactores, etc y en definitiva qué condiciones, dadas las características ambientales del habitat afectado y el tipo de fuel acumulado, son los óptimos para activar el metabolismo de dichas poblaciones degradadoras. Debido a la naturaleza altamente persistente de la carga del Prestige, el fuel vertido deambuló durante largo tiempo dirigido por los fuertes vientos y corrientes frente a la costa Noroeste de la Península Ibérica, afectando a diferentes hábitats de la misma. En consecuencia, la presente Tesis fue iniciada con el objetivo de estudiar las poblaciones bacterianas indígenas relacionadas con la degradación in situ del fuel del Prestige en dos ambientes marítimos representativos de la costa gallega con características distintas y, por lo tanto, con estrategias de respuesta diferentes frente al derramamiento. Sedimentos y agua de la Ría de Vigo (Capítulos I y II) y muestras de fuel acumulado sobre rocas y arena de la Costa da Morte (Capítulos III y IV) fueron muestreados en diferentes momentos tras la catástrofe del Prestige. La combinación de técnicas moleculares (análisis del gen 16S mediante -electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante- (DGGE), librerías de clones e hibridaciones in situ (FISH)) y aquellas basadas en cultivo (número más probable (MPN), enriquecimientos con hexadecano, fenantreno, etc.), fue utilizada para determinar la estructura de la comunidad bacteriana autóctona y su capacidad potencial y/o real de biodegradación. De hecho, la combinación de técnicas cultivo-dependientes e -independientes (como las moleculares) usadas en el presente estudio ha demostrado ser una metodología de gran potencia en el campo de la ecología microbiana del petróleo, siempre y cuando seamos conscientes de las limitaciones de cada una de las técnicas de forma aislada. Las identidades entre secuencias de ADN, del gen ribosomal ARN 16S, detectadas en los ambientes petroleados con las de especies bacterianas previamente relacionadas con la degradación de hidrocarburos, nos dan información sobre el metabolismo y la capacidad degradadora potencial de la comunidad estudiada. Sin embargo, tales semejanzas del 16S son simplemente orientativas de la capacidad catabólica real de una comunidad dada y se deben interpretar con precaución. En este sentido, nuestros estudios no se detuvieron en la simple descripción taxonómica de las comunidades microbianas. Muchas de las bacterias detectadas en los ambientes petroleados por medio de técnicas moleculares como potenciales agentes degradadores de diferentes fracciones del fuel del Prestige, tales como Alcanivorax, Rhodococcus, Citreicella, Dietzia, Sphingomonas, etc., se pudieron aislar y por lo tanto analizar en mayor profundidad respecto a su genética, fisiología e interacción con otros miembros de los consorcios bacterianos indígenas responsables de la biodegradación in situ del fuel del Prestige. La Ría de Vigo, (Galicia, NO España), está situada en el límite norte del sistema de afloramiento del NO Africano, y por lo tanto en un área donde las dinámicas de afloramiento-hundimiento sobre la plataforma continental (Arístegui et al., 2006) tienen una fuerte influencia sobre la hidrografía y, por lo tanto, la estructura y función de la comunidad planctónica de las Rías. De hecho, cambios en la estructura y la diversidad de la comunidad bacterioplanctónica de la Ría de Vigo fueron encontrados a lo largo del año , incluyendo la detección de nuevos miembros en todos los grupos importantes de bacterias. El afloramiento costero induce la afluencia de agua oceánica del este del Atlántico Norte (ENAW) en la Ría. (Alvarez-Salgado et al.,1993). Estas corrientes en profundidad proveen las aguas de las Rías gallegas con nutrientes (valores medios de nitrógeno (N) y fósforo (P) alrededor de 0.6 y 0.06 mg l-1 respectivamente; Nogueira et al.,1997) que hacen a la Ría de Vigo ser un ecosistema de gran valor ecológico y económico. Las Islas Cíes, parte del Parque Natural Illas Atlánticas, se sitúan en la boca de la Ría de Vigo y la producción del mejillón en esta región es la más alta de Europa y una de las más importantes en el mundo, dando empleo a 9000 personas directamente y a 20000 indirectamente (Figueiras et al.,, 2002). Los mejillones y otros moluscos que crecen en la Ría, son animales filtradores que acumulan sustancias contaminantes. Por lo tanto, las autoridades españolas prohibieron la comercialización de productos derivados de la Ría tras la catástrofe del Prestige provocando efectos negativos sobre la economía local. La respuesta primaria tras el vertido del Prestige mediante medios mecánicos (p.ej. colocación de barreras -booming-, barrido de fuel flotante -skimming-, recogida de fuel a mano por voluntarios, etc.) retiró varias toneladas de fuel. Sin embargo, gran parte de este fuel pesado se hundió y enterró bajo los sedimentos del Parque Natural desde donde puede ser remobilizado a día de hoy. La limpieza mecánica de estos sedimentos podría causar más daño que beneficio puesto que los fondos de este Parque son delicados habitats con un alto valor ecológico. Puesto que la biorremediación no es una opción factible (los tratamientos serían diluidos en el agua), y su limpieza a mano mediante buzos es una tarea cara y difícil, la opción más factible en tales casos es confiar en la atenuación natural del medio. A pesar del papel crítico de las comunidades bacterianas en la red de alimento oceánica, y por lo tanto en la producción de las Rías, hasta el presente estudio no había información disponible sobre dichas poblaciones y mucho menos de su potencial de biodegradación. En contraste con la mayor parte de comunidades oceánicas superficiales dominadas por miembros del grupo SAR11 (Morris et al.,, 2002), miembros de Roseobacter dominaron el bacterioplancton de la Ría de Vigo en detrimento de SAR11, que se adapta más a las condiciones oligotróficas de las aguas abiertas (González et al., 2000, Malmström et al., 2004, Rappé et al., 2002). Es bastante probable que esta dominancia de Roseobacter sea una característica de ecosistemas del NO de la Península Ibérica influidos por afloraciones de fitoplacton (Henriques et al., 2004). Diversos clados pertenecientes al linaje de Roseobacter (NAC11-7, DC5-80-3, DG1128, CHAB-I-5, AS-21, etc.) y nuevos grupos dentro de SAR11, SAR86, Betaproteobacteria, etc. fueron detectados en este estudio en estaciones específicas, lo que podría reflejar una tendencia estacional. Los diferentes clados podrían tener diferentes habilidades incluyendo la capacidad de biodegradación (Sekine et al., 2006), o presentar diversas preferencias ambientales, como la asociación con distintas especies de fitoplancton (Wagner-Dobler y Biebl, 2006; West et al., 2008). Cuando se añaden N y P en cantidades adecuadas a cultivos experimentales de agua de mar con petróleo crudo como única fuente de C y energía, Alcanivorax (Yakimov et al., 1998) y otras Gammaproteobacteria consideradas profesionales de la degradación de hidrocarburos (Harayama et al., 2004) como Cycloclasticus capaz de degradar compuestos poliaromáticos (Chung y King, 2001), aumentan rápidamente en número dominando la comunidad y, por lo tanto, promoviendo enérgicamente la tasa de biodegradación (Harayama et al., 2004, Kasai et al. 2001, Kasai et al. 2002b, McKew et al., 2007, Röling et al. 2002). El hecho de que hayamos detectado la presencia, en sedimentos y agua de la Ría de Vigo, de miembros de Alcanivorax degradadores de alcanos y Cycloclasticus, que responde a las adiciones HAP (Teira et al., 2007), indica que los niveles naturales de N, P y oxígeno presentes (Vilas et al. 2005) en este sistema de afloramiento son suficientes para promover el crecimiento de estas especies conocidas por jugar un papel fundamental en la atenuación natural de vertidos de petróleo en los sistemas marinos. a) La contaminación crónica de hidrocarburos de la Ría (derrames de petróleo, industrial y de la escorrentía urbana, etc); b) los factores abióticos favorables de la Ría para el metabolismo de bacterias dgradadoras de hidrocarburos (altos niveles de oxígeno y nutrientes); c) la presencia de forma natural de géneros considerados fundamentales en la degradación de alcanos (Alcanivorax sp.) HAPs (Cycloclasticus sp.); d) el predominio y la diversidad de secuencias Roseobacter (un género previamente relacionado con la biodegradación de petróleo (McKew et al., 2007)); e) la alta población (MPN) de degradadores de alcanos en los sedimentos de la Ría tras el vertido (Alonso-Gutiérrez et al., 2008); f) la falta de efectos de los HAPs en la estructura del bacterioplancton autóctono (Lekunberri et al. submitted; Lekunberri, 2008) y g) el hecho de que procesos de biorremediación en curso ya se detectasen en el entorno de la Ría (Medina-Bellver et al. 2005), apoyan la teoría de la existencia de una comunidad autóctona preadaptada a la degradación de hidrocarburos en la Ría de Vigo, que pueden utilizar los contaminantes como fuente de C y energía. Por lo tanto, la atenuación natural en la Ría de Vigo es probablemente bastante efectiva y por lo tanto puede asumirse que los hidrocarburos disueltos en el agua tras la catástrofe podrán ser consumidos con relativa rapidez por la comunidad bacteriana autóctona. Tras la aplicación de métodos físicos de limpieza, se tomó la decisión de utilizar la biorremediación como una medida secundaria para la limpieza del fuel del Prestige acumulado en zonas de difícil acceso como la "Costa da Morte". La eficacia de diferentes formulaciones de carácter comercial fue comparada y después de diferentes ensayos sobre el terreno, el fertilizante oleofílico S-200 demostró ser el más efectivo y por lo tanto, se utilizó para limpiar diferentes zonas a lo largo de la costa NO de España donde los tratamientos mecánicos no eran viables y / o conveniente. Aunque su eficacia fue diferente entre las zonas tratadas (Murado, MA et al.. pers. comm.) no hubo más evaluaciones antes de su aplicación en diferentes sitios. Esa variabilidad en el éxito del tratamiento se debe probablemente a las diferencias entre las comunidades bacterianas autóctonas. Roca, arena e incluso agua, fuertemente afectadas por el vertido del Prestige un año antes, fueron muestreados en diferentes lugares antes de la aplicación del S-200. Los análisis reflejados en el presente estudio de comunidades bacterianas pertenecen a muestras de roca y arena petroleadas de zonas de la "Costa da Morte", donde la consiguiente aplicación de S-200 fue exitosa. Por lo tanto, los resultados presentados en esta memoria científica proporcionan una valiosa información acerca de las comunidades bacterianas que responden positivamente a las aplicaciones de fertilizantes de tipo oleofílico y arroja luz sobre el desarrollo de nuevas estrategias de biorremediación. El análisis de identificación (fingerprinting) del fuel acumulado en las costas rocosas en estudio mostró un alto grado de meteorización (weathering), que está en consonancia con las tendencias que siguen a la biodegradación (Jiménez et al., 2006). Por lo tanto, tal como se hipotetizó para las comunidades microbianas de la Ría de Vigo, podemos concluir que las comunidades bacterianas de la "Costa da Morte" presentan una buena tasa de biodegradación del hidrocarburo acumulado. Esta afirmación es apoyada por las condiciones ambientales del hábitat afectado y la estructura de la comunidad bacteriana detectada. La "Costa da Morte" (Galicia, NO España) también se ve afectada por el afloramiento del NO de África (Arístegui et al., 2006) y, por tanto, es un área donde los niveles de nutrientes (0,20 - 0,25 mg l-1 de N total (Alvarez -Salgado et al., 2002)) son más adecuados para los procesos de biodegradación que los del Mar del Japón (Total N ~ 0,1 mg l-1). En los primeros momentos después de un derrame de petróleo, las comunidades de bacterias marinas son dominadas por diferentes Gammaproteobacteria (Röling et al., 2002). Sin embargo, cuando los factores ambientales son adecuadas para los procesos de biodegradación, el petróleo es rápidamente degradado y las comunidades dominadas por Gammaproteobacteria son rápidamente sustituidas por una comunidad más diversa (Röling et al., 2002), al igual que la que encontrada doce meses tras el vertido del Prestige. Alrededor de un año después del accidente del petrolero Nakhodka en el Mar del Japón, muestras de petróleo de una composición similar a la del Prestige, aún estaban dominadas por Gamma y Alphaproteobacteria (bacterias Gram-negativas) (Kasai et al., 2001; Maruyama et al. , 2003), mientras que, Alphaproteobacteria y Actinobacteria (Grampositivas) dominaban nuestras muestras afectadas por el Prestige después de el mismo tiempo. La estructura trófica de las comunidades bacterianas afectadas por el vertido poseían un porcentaje significativamente mayor de poblaciones degradadoras de alcanos y aromáticos que las no afectadas. Por otro lado, aunque las rocas y arena son muy diferentes sustratos, la composición de las comunidades bacterianas observadas eran muy similares entre sí. Todo ello indica que el petróleo dirigió la composición final de las comunidades bacterianas observadas. Muchos miembros de las comunidades detectados en este estudio fueron anteriormente asociados con la degradación de alcanos (Xanthomonadaceae, Pseudoxanthomonas, Stenotrophomonas, Erythrobacter, etc (Chang et al., 2005; Joven et al., 2007; Macnaughton et al., 1999; Roling et al. , 2002)) y aromáticos (Citreicella sp., Sphingomonadaceae spp. Lutibacterium anuloederans, descrita como una bacteria degradadora de HAP de 2 y 3 anillos con una mayor eficiencia que Cycloclasticus spp. (Chung y King, 2001; McKew et al., 2007), etc). Sin embargo, fue Actinobacteria (principalmente miembros del suborden Corynebacterineae) el grupo clave en los procesos de degradación in situ del fuel del Prestige tras un año a la intemperie. Este grupo de bacterias Gram-positivas incluye géneros detectados en el presente estudio, tales como Mycobacterium, Williamsia, Gordonia, Dietzia y Rhodoccoccus. Tanto las técnicas moleculares como las basadas en cultivo pusieron de manifiesto el papel preponderante del género Rhodococcus, como degradador de la fracción alcánica remanente del Prestige. Es bien sabido que Rhodococcus es un género con una notable diversidad metabólica (Larkin et al., 2005) y capaz de producir biosurfactantes que hacen el fuel más disponible y mejoraran las actividades de otras bacterias degradadoras (Iwabuchi et al., 2002; Murygina et al., 2005 ; Van Hamme y Ward, 2001)). Otras Actinobacteria con características similares a Rhodococcus y capaces de degradar alcanos lineales e incluso ramificados como Gordonia, Dietzia y Microbacterium (Rainey et al., 1995; Yumoto et al., 2002), también formaban parte de la misma comunidad bacteriana. Ensayos de degradación realizados con las cepas aisladas de Dietzia revelaron interesantes características de esta Corynebacteria. La cepa estudiada fue capaz de producir hexadeceno cuando usaba hexadecano como fuente de carbono. Esto puede representar una nueva vía de degradación con respecto a lo descrito hasta el momento donde las moléculas de alcanos son oxidadas por un extremo (van Beilen and Funhoff, 2007). La información para realizar esta ruta catabólica podría estar codificada por genes aislados de esta cepa (alkB y CYP153) en el presente estudio. Aunque esta característica puede no tener utilidad para fines de biorremediación podría ser útil para procesos de bioconversión. De hecho, los esfuerzos realizados para aislar bacterias se hacen no sólo con el objetivo de evaluar su capacidad degradadora y sus requerimientos, sino también para aislar cepas que puedan contener nuevas vías de degradación de utilidad para la industria (Harayama et al., 2004; Van Hamme et al., 2003) . El suborden Corynebacterineae también podría desempeñar directamente un papel importante en la degradación de los HAP puesto que el género Mycobacterium, especializado en la degradación de aromáticos adsorbidos al sustrato (Bastiaens et al., 2000), se detectó en las librerías de clones en alta proporción. La capacidad de L. anuloederans y Mycobacterium spp. para degradar fluoreno y pireno (Grifoll, M., com. pers.), que se consideran componentes especialmente recalcitrantes del petróleo (Wammer and Peters, 2005), podría explicar la alta proporción de estas bacterias en las muestras de fuel pesado bajo estudio, que carece de la mayor parte de las fracciones más susceptibles a la biodegradación. A diferencia de las Gammaproteobacteria (Alcanivorax, Cycloclasticus, Thalassolituus...) que dominan con sus altas tasas metabólicas en las primeras fases del proceso de degradación del petróleo (Kasai et al., 2002b), los miembros de Corynebacterineae nunca son dominantes en esas etapas, detectándose con mayor frecuencia en entornos de recursos limitados (Margesin et al., 2003; Quatrini et al ., 2008). Este grupo debe desempeñar, por lo tanto, un papel clave en la degradación in situ de los componentes más recalcitrantes que dominan la composición del fuel acumulado a largo plazo después de un accidente (Quatrini et al., 2008). Los resultados obtenidos mediante ensayos de degradación de alcanos, realizados con las cepas de Rhodococcus y Dietzia aisladas del consorcio degradador autóctono, también apoyan esta hipótesis. Dietzia spp. utilizó alcanos de cadena larga (LCL) y ramificados sólo cuando los de cadena corta habían sido consumidos. Probablemente, es esta capacidad la que permite a este género mantener sus poblaciones largos períodos de tiempo después de un derrame de petróleo cuando el combustible residual ya se ha enriquecido en aquellas fracciones menos susceptibles a la degradación. Además, los genes degradadores de hidrocarburos, alkB y CYP153, detectados en este estudio, y sus respectivas hydroxilasas, se expresaron constitutivamente independientemente de la fuente en C en ambos géneros (Dietzia y Rhodococcus). Esto explica por qué estas bacterias Gram-positivas, a pesar de degradar hidrocarburos, no varían en respuesta a un derrame de petróleo (Margesin et al., 2003). Por el contrario, las Gammaproteobacteria (Gram-negativas) como Alcanivorax, son capaces de aumentar en número rápidamente tras un vertido en respuesta al alto aporte de hidrocarburos gracias a la expresión inducible de su maquinaria catabólica (Yuste et al., 1998; Sabirova et al., 2006). Como conclusión, podría considerarse que el fuel oil depositado en las costas marinas representa en sí mismo un hábitat que es objeto de colonización bacteriana y de la consiguiente sucesión de comunidades, donde las bacterias Gram negativas como Gammaproteobacteria podrían considerarse estrategas de la r mientras las Gram positivas (Actinobacteria) actuarían como estrategas de la K en etapas posteriores del proceso de biodegradación gracias a su versatilidad catabólica (Larkin et al., 2005) que les hace capaces de crecer a base de las fracciones más recalcitrantes del fuel en avanzado estado de degradación. Si el metabolismo de biodegradación de los estrategas de la K (bacterias Gram positivas) es diferente al de los estrategas de la r (bacterias Gram negativas), como se ha demostrado en el presente estudio, parece bastante obvio pensar que los requisitos para activar cada uno de esos metabolismos debería ser de la misma forma, diferente. A pesar de ello, las enmiendas aplicadas suelen ser siempre las mismas independientemente del estado de biodegradación del fuel y de la etapa de sucesión. Esta información siempre fue desconocida en el caso del Prestige cuya estrategia de biorremediación se basó exclusivamente en resultados empíricos. Por lo tanto, en base a nuestras observaciones y a estudios anteriores, se proponen diferentes ideas para mejorar las actuales estrategias de bioremediación y/o desarrollo de nuevas formulaciones de biorremediación que puedan ser de aplicación en zonas petroleadas a largo plazo en el medio ambiente marino. Estrategias de bioremediación en la "Costa da Morte" y hábitats similares Las conclusiones derivadas del presente trabajo podrían aplicarse a otras partes del litoral español afectadas por el vertido del Prestige ya que muchos de los miembros clave del consorcio estudiado (Rhodococcus, Chromatiales, Rhodobacteriaceae, Roseobacter- (Citreicella), Erythrobacter etc.) también se detectaron a 400 km de distancia en entornos similares afectados por el Prestige (Jiménez et al., 2007). Por lo tanto, la comunidad estudiada parece representar una especie de "comunidad clímax" dirigida por la presencia de fuel del Prestige tras haber sido degradado y enriquecido en sus fracciones recalcitrantes. Los microorganismos son capaces de producir biosurfactantes que mejoran la biodisponibilidad y degradación del petróleo en el medio ambiente (Ron y Rosenberg, 2001, 2002). Los ácidos micólicos, son moléculas tensioactivas características del suborden Corynebacterineae, que proporcionan a estas bacterias Gram-positivas una barrera exterior que explica tanto la limitada permeabilidad de sus paredes celulares como su capacidad de adhesión y su baja susceptibilidad a agentes tóxicos (Gebhardt et al. 2007). Aunque el uso de biosurfactantes no suele ser una respuesta viable ante vertidos de petróleo dado que son caros de producir, la utilización de ácidos micólicos, análogos a los naturales pero sintetizados químicamente a bajo coste, se mostró eficaz a la hora de aumentar la capacidad de biodegradación de Rhodococcus y otras Actinobacteria degradadoras de hidrocarburos (Linos et al., 2000; Lee et al., 2006). Rhodococcus por sí misma produce agentes tensioactivos que mejoran las actividades biodegradadoras de los demás miembros del consorcio (Iwabuchi et al., 2002) y, por tanto, la adición de ácidos micólicos sintéticos a las actuales fórmulas biorremediadoras podría aumentar su eficacia a la hora de ser aplicadas en zonas de la costa petroleadas hace tiempo dado que sus comunidades degradadoras estarán probablemente dominadas por Corynebacterineae. En el presente trabajo también se pusieron de manifiesto interacciones entre los miembros de la comunidad bacteriana autóctona que llevaba a cabo la biodegradación del fuel del Prestige in situ. Estas interacciones son de gran importancia en el proceso de degradación pero demasiado complejas para tratar de estudiar todas ellas. Los resultados de este estudio dan algunas pistas sobre posibles interacciones positivas que podrían ser aumentadas por los tratamientos de biorremediación. Nuestros resultados apoyan la hipótesis anterior (McKew et al., 2007) de que Tistrella mobilis es una bacteria oportunista que crece a base de metabolitos secundarios (por ejemplo, catecol) derivados de los procesos de degradación de HAPs llevados a cabo por las bacterias verdaderamente capces de romper el anillo aromático. Ahora que hemos aislado Tistrella, sería interesante estudiar si la presencia de esta bacteria, que 'roba' catabolitos intermedios del proceso de degradación, podría acelerar la rotura de nuevos anillos aromáticos por la bacteria degradadora con el fin de compensar esa pérdida. También se observó que las especies de Rhodococcus y principalmente Citreicella requerían algún cofactor, probablemente una vitamina, para desarrollar sus actividades degradadoras de alcanos y aromáticos, respectivamente. Los miembros pertenecientes a Actinobacteria del consorcio en estudio, como por ejemplo Dietzia, pueden proporcionar tales cofactores. La aplicación de estos cofactores podría ser de su interés con el fin de mejorar los tratamientos de biorremediación. Aunque la detección de estos cofactores podría requerir una gran cantidad de trabajo (extractos de levadura contienen una multitud de diferentes vitaminas, etc), nuestras observaciones podrían orientar una investigación más a fondo en ese respecto.