Inserción de fluorocromos en el gen env de VIH-1 para el análisis de resistencias fenotípicas a antirretrovirales

Resumo

El análisis de resistencia a antirretrovirales puede realizarse por técnicas de genotipado y de fenotipado. Estas últimas utilizan métodos biológicos complejos, de no muy alta eficacia y limitada seguridad. Kellam, P., y Larder, B.A. (1994) desarrollaron métodos utilizando virus recombinantes y Boucher, C.A., y cols. (1996) han desarrollado esta metodología utilizando el ensayo con MTT tratando de simplificar y ajustar el procedimiento para usarlo con virus recombinantes generados a partir del suero de pacientes. La adaptación de la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria (GFP) a técnicas de ingeniería genética y citometría de flujo, supone una importante alternativa en las construcciones que pueden utilizarse para el trabajo con retrovirus. De este modo creemos en la posibilidad de lograr un diseño experimental ajustado que permita la expresión a títulos detectables de GFP y de esa forma mejorar la cuantificación de los efectos fenotípicos de las construcciones de VIH-1. El objetivo de este trabajo fue la construcción de vectores basados en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) para poder: I,- Desarrollar modelos adecuados de valoración de resistencias fenotípicas a antirretrovirales. II,- Construir pseudotipos basados en VIH-1 que mejoren los títulos de virus obtenidos, el rango de células hospedadoras y la seguridad. El vector original para este trabajo es el pNL4.3 y como sistema marcador hemos utilizado la proteína fluorescente (EGFP) cuya expresión hemos valorado por citometría de flujo. III,- Comparación de la efectividad del marcador fluorescente en la célula o en el vector. IV,- Comparación de la infección en dos líneas celulares diferentes CEM-SS y MT2. CONCLUSIONES 1,- La inserción del gen EGFP en el gen env de VIH-1 genera vectores retrovirales infectivos y capaces de expresar la proteína verde como consecuencia de la replicación viral al ser contrasfectados