Estudio de la expresión de la protimosina [alfa] en células embrionarias y de su mecanismo de fosforilación

Resumo

La Protimosina a (ProT¿) es un polipéptido muy acídico de peso molecular 12,5 Kda, de presencia preferente en mamíferos en una gran variedad de tejidos y órganos, implicada en un proceso intracelular básico y, relacionada con la actividad proliferativa de las células. Con la intención de esclarecer su función y dado que los mecanismos de proliferación celular son esenciales y especialmente activos durante las primeras fases del desarrollo embrionario, analizamos la distribución espacial de la expresión de ProT¿ en este período. Encontramos que la expresión del mRNA de ProT¿ durante las primeras fases de postimplantación del desarrollo embrionario del ratón es muy baja a 6,5 dpc, se incrementa durante los estadios de 6,5 dpc-8,5 dpc y permanece constante entre 8,5 dpc-12,5 dpc. Además, el gen de ProT¿ se expresa casi exclusivamente en ectodermo, así como en estructuras derivadas del mesodermo y no en células que darán lugar al endodermo definitivo. Por otro lado, el hecho de que la ProT¿ se fosforile en la región N-terminal de su secuencia, durante el proceso de fosforilación celular, nos ha llevado a investigar los aminoácidos que en dicha región, resultan fosforilados por la Proteína quinasa de ProT¿ (ProTK) que ha sido aislada en nuestro laboratorio. Para ello, produjimos por mutagénesis dirigida una serie de cDNAs matantes de ProT¿ que contienen alterados los locus de fosforilación: Thr 7, 12 y 13, y, Ser 8 y 9. Expresamos estos cDNAs como proteínas de fusión que purificamos por cromatografía de afinidad en Glutation sepharosa y, con ellos, realizamos los ensayos de fosforilación con la ProTK. Estos análisis demostraron que todos los residuos de treonina se implican en la fosforilación de ProT¿, mientras los de serina no son fosforilados. El hecho de que la supresión de la Thr 7 conlleva un descenso de la mitad de la actividad fosforilante, mientras la supresión de los residuos 12 y 13 de treonina, sólo afectan, en cada uno, a un descenso de la cuarta parte de la capacidad de fosforilación de la ProT¿ salvaje, parece indicar que la Thr 7 contribuye en un 50% a la capacidad de fosforilarse de la ProT¿, mientras que los residuos Thr 12 y 13 contribuyen conjuntamente en otro 50%.