Diseño y síntesis de nuevos derivados monocuaternizados con actividad antitumoral y antimalárica

Resumo

1.- Introducción Cáncer y malaria son dos enfermedades de gran prevalencia a nivel mundial que adolecen de terapias efectivas, seguras y sin resistencias. Es este el motivo por el cual se hace imprescindible la investigación de nuevos fármacos capaces de combatir ambas enfermedades. Una de las nuevas estrategias se centra en la inhibición de colina quinasa (ChoK), que es una enzima citosólica responsable de catalizar la conversión de colina (Cho) a fosfocolina (PCho) en presencia de ATP y Mg2+. La PCho es un intermedio de la síntesis de fosfatidilcolina (PC), un fosfolípido esencial en la formación de la membrana celular. Además, la PCho es también un segundo mensajero capaz de activar rutas de señalización que tienen por objetivo último, la proliferación celular. La inhibición de ChoK conduce a una disminución de los niveles de PC y por tanto, de la proliferación celular tanto en células de mamífero transformadas como en Plasmodium sp. 2.- Objetivos Siendo patente la utilidad de ChoK en el tratamiento del cáncer y de la malaria, los objetivos de la presente Tesis Doctoral son los que siguen: 1. Elucidar un modelo de farmacóforo que pueda usarse para: a. Buscar mediante cribado virtual prototipos con afinidad por ChoK. b. Optimizar el farmacóforo mediante síntesis química para obtener nuevos compuestos con mejor afinidad por la enzima, mayor potencia inhibitoria y mejores propiedades antiproliferativas que los prototipos del punto anterior. 2. Evaluar biológicamente los compuestos (tanto los del punto 1.1, como 1.2) mediante espectroscopía de fluorescencia de triptófanos, así como realizar estudios de inhibición enzimática y actividad antiproliferativa frente a diversas líneas tumorales (HepG2, A549, HCT116, Jurkat, Mia Paca y MCF7). 3. Realizar experimentos de cristalografía para explicar desde el punto de vista de reconocimiento molecular los resultados de afinidad e inhibición observados. 4. Llevar a cabo un estudio comparativo de ChoK en sus homólogas (HsChoK¿1, PfChoK y CpChoK) para analizar su similitud a nivel estructural. 5. Determinar la actividad antimalárica de los compuestos sintetizados. 6. Establecer las relaciones estructura química- actividad para las tres familias de compuestos sintetizados. 3.- Resultados y Discusión 3.1. Diseño del farmacóforo La elucidación del farmacóforo se llevó a cabo a partir de una librería de 83 inhibidores biscatiónicos simétricos de HsChoK¿1 previamente sintetizados por nuestro grupo de investigación y también a partir de la estructura tridimensional de la enzima. Tras varias aproximaciones infructuosas, la hipótesis finalmente elegida fue la constituida por 3 anillos aromáticos, una carga positiva y un nitrógeno exocíclico distribuidos espacialmente según la geometría del fragmento de 1-bencil-4-(N-metilanilino)piridinio. 3.2. Cribado virtual El farmacóforo diseñado en la primera etapa de la investigación, fue aplicado de manera simultánea tanto en el descubrimiento de nuevos hits con afinidad por la HsChoK¿1, como en la síntesis química de nuevos inhibidores. Para ello, se enriqueció con volúmenes de exclusión derivados de la unión del fragmento de 1-bencil-4-(N-metilanilino)piridinio a la HsChoK¿1 para posteriormente explorar las librerías Enamine, Chembridge y Life Chemicals. Como resultado, fueron seleccionados 8621 compuestos que se filtraron en tres etapas posteriores para reducir las posibilidades de encontrar falsos positivos. En la primera etapa, se aplicó como criterio el valor de Fitness score. En la segunda etapa, se realizó un docking de los 72 seleccionados en la etapa anterior, de modo que sólo se eligieron los 20 primeros compuestos con mejor valor de Prime docking score. Por último, en la etapa final se eligieron los 11 compuestos más accesibles en base a su precio y disponibilidad comercial. A continuación, los 11 seleccionados se evaluaron biológicamente frente a HsChoK¿1 mediante espectroscopía de fluorescencia de triptófanos, de modo que sólo 6 mostraron unión a la proteína con valores de afinidad (Kd) de 0,44-7,9 µM. Además, los mismos experimentos realizados sobre HsChoKß demostraron que su unión era de 3 a 160 veces más selectiva frente a la isoforma ¿ que frente a la ß, lo cual es importante para evitar efectos adversos a nivel muscular. Por otro lado, los cálculos de eficiencia (Ligand efficiency) pusieron de manifiesto que cuatro de los seis compuestos eran más eficientes que otros compuestos más voluminosos y pesados, tales como el hemicolinio-3 (HC-3), demostrándose así la mayor contribución energética de cada uno de sus átomos en la unión al enzima. Por último, los ensayos de inhibición enzimática de los seis compuestos frente a HsChoK¿1 mostraron un reducido porcentaje de inhibición a una concentración de 50 µM. No obstante, debido a que tanto la Kd como los estudios de docking indicaban unión al sitio de la colina de la enzima, se realizaron experimentos de cristalografía para encontrar la causa de tan pobre resultado de inhibición. Finalmente, la estructura cristalina del complejo HsChoK¿1/5217714 reveló la existencia de dos moléculas de compuesto dentro del sitio activo. En consecuencia, la explicación más razonable para la escasa inhibición se basa en el mecanismo de acción propuesto para HsChoK¿1 por Pollard y colaboradores. De acuerdo con éste, probablemente tenga lugar un desplazamiento de los compuestos del sitio activo por impedimento estérico con el Asp306 fosforilado. A pesar de la escasa inhibición mostrada por los seis compuestos, el análisis biológico reveló que el compuesto 5664997 presentaba un valor de EC50 de 9,59 ± 2,64 µM y 7,44 ± 0,72 µM frente a las líneas celulares A549 y HT29, respectivamente. Dada la escasa inhibición que demostró tener frente a la enzima recombinante (23 % a 50 µM), la disminución de la viabilidad celular a la que da lugar podría deberse a un efecto inespecífico sobre otras dianas distintas a ChoK. 3.3. Optimización del farmacóforo: síntesis química, evaluación biológica y estudios de cristalografía. 3.3.1. Síntesis química En total, se sintetizaron 35 productos finales que fueron diseñados para interaccionar con la enzima a través del sitio de la colina, tal y como sucede con el farmacóforo. Se trata de sales de piridinio (4-(N,N-dimetilamino)piridina o 4-pirrolidinopiridina) o quinolinio (7-cloro-4-(N-metilanilino)quinolina o 7-cloro-4-(perhidroazepin-1-il)quinolina), de acuerdo a la naturaleza de su cabeza catiónica, que se engloban en tres familias, denominadas familia A, familia B y familia C en función de su espaciador y de la presencia o no de aminas terciarias como sustituyentes del mismo. 3.3.2. Evaluación biológica Los ensayos biológicos llevados a cabo, han permitido concluir que de los cinco grupos funcionales propuestos por el modelo inicial de farmacóforo (carga positiva, tres anillos aromáticos y nitrógeno exocíclico) el fenilo del N-metilanilino no es condición necesaria para conseguir unión a la proteína. No obstante, aunque estos cuatro grupos por sí solos sean suficientes para la unión a la HsChoK¿1, parecen no serlo para conseguir una buena actividad inhibitoria y antiproliferativa. En consecuencia, la optimización del farmacóforo implica la introducción de un fenilo adicional tanto en el espaciador como en el anillo de piridina para dar lugar al sistema quinolínico y de aminas. Así, además de aumentar notablemente la afinidad por la proteína, se mejora la capacidad inhibitoria de los compuestos y al mismo tiempo, su actividad antiproliferativa por incremento de su lipofilia. 3.3.3. Estudios de cristalografía Los estudios de cristalografía aportaron las evidencias experimentales mediante las que se dio explicación a los resultados de afinidad por HsChoK¿1, así como a los valores de inhibición observados. En general, el aumento paulatino de la Kd y la CI50 a medida que se incrementa la complejidad de los compuestos finales se correlaciona con un número creciente de interacciones ¿-¿. 3.4. Estudio comparativo de los sitios activos de ChoK homólogas El estudio computacional comparativo de las ChoK homólogas se llevó a cabo con el objetivo de abrir nuevos campos de acción para los inhibidores de HsChoK¿1 y por tanto, encontrarles nuevas aplicaciones para el tratamiento de otras enfermedades distintas al cáncer. Los análisis de conservación estructural y el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de HsChoK¿1 con otras ChoK de patógenos eucariotas y procariotas, dio como resultado una alta conservación de residuos en los sitios activos de Plasmodium falciparum, P.Knowlesi y Cryptosporidium parvum, ya que el porcentaje de identidad era del 69 % y del 80 %, respectivamente. Por otra parte, los estudios de dinámica molecular (MD) evidenciaron que las cuatro homólogas presentaban un mecanismo de reconocimiento de ligandos muy parecido. Las dos evidencias anteriores, indicaban que el efecto mostrado por un determinado ligando (inhibidor o no) en una de las las ChoK homólogas, sería extrapolable a las demás. Con el objetivo de validar dicha hipótesis de trabajo, se llevaron a cabo estudios de fluorescencia de triptófanos y ensayos de actividad enzimática con dos de los compuestos sintetizados en la Tesis Doctoral (B.1 y C.4.4). Los resultados mostraron que la afinidad con la que ambos compuestos reconocían a las ChoK homólogas era muy similar para las tres enzimas (Kd de 265, 430 y 425 nM para HsChoK¿1, PfChoK y CpChoK, respectivamente). Además, se confirmó que el compuesto C.4.4 es inhibidor de las tres enzimas. El estudio se completó llevando a cabo ensayos de actividad antiproliferativa (frente a HepG2, A549, HT29, HCT116, Jurkat y MCF7) y antimalárica (frente a eritrocitos infectados) de C.4.4, comprobándose una mayor potencia como agente antipalúdico que como agente anticancerígeno. 3.5. Actividad antimalárica de los compuestos sintetizados Dada la similitud estructural de HsChoK¿1 con sus homólogas (PfChoK y CpChoK) que se puso de manifiesto tras la realización de los estudios computacionales comparativos, se procedió a la realización de ensayos de fluorescencia frente a PfChoK y de actividad antimalárica en eritrocitos infectados. A la vista de los resultados de los experimentos, se corroboró que todos los compuestos mostraban además de afinidad por la proteína, actividad antimalárica. De modo similar al comportamiento mostrado frente a HsChoK¿1 y líneas celulares cancerosas, los compuestos finales aumentaban su actividad antimalárica a medida que se incrementaba la complejidad de la molécula. Esto se debía a una mejora gradual de la afinidad por la PfChoK y también presumiblemente, al aumento de lipofilia. Al igual que se observó para el compuesto C.4.4, la potencia como antimaláricos es superior a la que muestran como agentes antiproliferativos, lo cual pone de manifiesto la posible participación de mecanismos de transporte activo en las membranas del parásito y la sinergia con otras dianas estructuralmente parecidas a la ChoK que no se inhiben en células humanas. De todos los compuestos ensayados, el mejor agente antipalúdico fue el compuesto C.3.1, que siendo el segundo más afín por PfChoK, presentó un valor de CI50 (49 nM) próximo al de la cloroquina (23,11 nM). 4. Conclusiones 1. El análisis computacional de los inhibidores de HsChoK¿1 de estructura simétrica biscatiónica, ha permitido proponer un modelo de farmacóforo constituido por cinco grupos funcionales (RRRPN) que ha sido usado como herramienta en estudios de cribado virtual y de síntesis química. 2. Mediante el cribado virtual se han descubierto seis prototipos que muestran afinidad por HsChoK¿1, pero que carecen de efecto inhibitorio. No obstante, los estudios de cristalografía han revelado que se unen al sitio activo, de modo que, probablemente durante la reacción catalítica tenga lugar la expulsión del compuesto mediante mecanismos que desconocemos. 3. La optimización del farmacóforo mediante un proceso de farmacomodulación ha dado como resultado un total de 45 productos finales organizados en tres familias (A, B y C) en función de la naturaleza química de su espaciador. En conjunto, el aumento de complejidad de la estructura química conlleva un aumento gradual de afinidad y actividad inhibitoria frente a HsChoK¿1, así como de potencia antiproliferativa frente a las líneas celulares HepG2, A549, MCF7, HCT116, HT29, Mia Paca y Jurkat. 4. Los estudios de cristalografía de la forma holo- de HsChoK¿1 con varios compuestos, evidencian que el aumento gradual de afinidad por la proteína a medida que se incrementa la complejidad de la estructura química de los compuestos sintetizados, puede deberse a una mejora del perfil de interacción que contribuye a aumentar la estabilidad del complejo proteína-ligando. 5. El estudio comparativo de ChoK homólogas (HsChoK¿1, PfChoK, PkChoK y CpChoK) demuestra un alto grado de conservación de los sitios activos y un mecanismo de reconocimiento de ligandos muy parecido. La validación biológica de las evidencias previas ha permitido concluir que los compuestos mostrarán un efecto muy parecido (inhibitorio o no) en todas las homólogas. Esto podría ser de interés para tratar malaria y criptosporidiosis con fármacos anticancerígenos que sean inhibidores de ChoK. 6. Los estudios de fluorescencia de los compuestos sintetizados frente a PfChoK, así como de actividad antimalárica en eritrocitos infectados con P.falciparum ponen de manifiesto que los compuestos sintetizados son potentes agentes antipalúdicos. Además, dicha actividad es mucho más potente que su actividad antiproliferativa, y por ejemplo el compuesto C.3.1, cuya potencia (CI50 = 49 nM) es muy similar a la de la cloroquina (CI50 = 23 nM), es 218 veces más selectivo de eritrocitos infectados que de células sanas.