Biomonitorización de contaminación por TBT y genética poblacional en "Nassarius reticulatus" (L) y "N. nitidus" (Jeffreys) en el NE Atlántico

Resumo

ANTECEDENTES: Los eventos geológicos y climáticos, así como aquellos relacionados con la hidrografía, en asociación con los rasgos especie-específicos, han jugado históricamente un papel importante en la distribución, estructuración, tamaño poblacional y separación de especies presentes hoy en día. Hasta donde tenemos constancia, los cambios cíclicos de temperatura ocurridos durante el Cuaternario (últimos 2.58 Ma) tuvieron una fuerte repercusión en la diferenciación inter- e intrapoblacional de un amplio número de especies marinas, especialmente en el hemisferio norte. Durante este periodo se han identificado hasta 52 estadios fríos (glaciales) y cálidos (interglaciales), los cuales en ocasiones alcanzaron niveles extremos. Entre estos, el Último Máximo Glacial (UMG, 26.5-19 ka AP) ha tenido una importancia especial para los organismos de intermareal, debido a que su hábitat en ocasiones quedó cubierto por las capas de hielo en crecimiento, en ocasiones quedó descubierto tras la bajada del nivel del mar. Asimismo, los eventos geológicos deben destacarse como origen de fuertes discontinuidades genéticas, las cuales, con frecuencia son comunes para un amplio número de organismos compartiendo un mismo rango geográfico, independientemente de sus características de desarrollo biológico. El caso de la división Atlanto-Mediterránea se trata de un ejemplo de diferenciación ocasionada por cambios en el entorno físico. La mayor parte de la biota presente hoy en día en el Mar Mediterráneo es el resultado de una colonización desde el Océano Atlántico a raíz de la reapertura del Estrecho de Gibraltar (EG) y la brusca inundación de la cuenca Mediterránea hace 5.33 Ma. Sin embargo, debido a la implicación de otros factores (como el hábitat, corrientes y las características especie-específicos, mencionados anteriormente) la respuesta de cada especie a los citados agentes de transformación ha sido independiente. Es por ello que si bien se confía exista concordancia en los patrones filogeográficos de la biota de una determinada región, esta no es necesaria. Volviendo a la separación que constituye el EG y el Frente Almería-Orán (FAO), a pesar del efecto homogeneizador que constituyeron los eventos geoclimáticos, existe una gran variedad en cuanto a distribución espacial y estructura poblacional se refiere entre los cuerpos de agua del Atlántico y el Mediterráneo. Por ejemplo, el 25% de las especies marinas mediterráneas son endémicas. Asimismo, existen organismos pelágicos y bentónicos de distribución atlanto-mediterránea cuya estructura genética muestra una clara rotura entre ambas cuencas. De igual modo, los procesos demográficos asociados a estas poblaciones se han demostrado diversos. Mientras que algunas poblaciones parecen haberse mantenido en equilibrio durante los últimos millones años, la señal genética otras revela un crecimiento demográfico exponencial largo y lejano en el tiempo, una expansión reciente, o incluso la ocurrencia de un fuerte cuello de botella. Ejemplo de la dificultad que existe para predecir cómo han respondido los organismos marinos al conjunto de factores biológicos y geoclimáticos es que ninguna de las pautas demográficas observadas a ambos lados del EG ni los patrones de aislamiento poblacional (parcial o completo) en el Atlántico y Mediterráneo han podido ser relacionados directamente con la capacidad de dispersión o el tipo de desarrollo. El tipo de estudio filogeográfico mencionado con anterioridad se complica cuando la señal de los sucesos naturales se ve enmascarada por el flujo genético artificial reciente: la intensa actividad que el hombre ha desarrollado a lo largo y ancho de los mares del mundo durante los últimos siglos se ha materializado en el recorte de distancias y la eliminación de barreras biogeográficas al movimiento de organismos. Lo anterior, sumado al un cambio en las condiciones físicas, químicas y biológicas provocado por el calentamiento global o la alteración del medio por acción del hombre ha traído como consecuencia una serie de procesos poblacionales hasta el momento insospechados: asentamientos de invertebrados, peces, fitoplancton y algas en regiones distantes de aquella donde ocurren de manera habitual, incrementos rápidos en el rango de distribución de especies o, al contrario, reducciones drásticas de este, a través de la desaparición a nivel local de, hasta hace poco, asentamientos densos. Un ejemplo llamativo de la alteración del medio por motivos antrópicos se trata de la insidiosa contaminación marina a raíz del uso del compuesto tributilo de estaño TBT (del inglés tributyltin) como agente anti-incrustante. La bioincrustación (biofouling) consiste en el asentamiento y crecimiento indeseado de seres vivos en superficies sumergidas. La comunidad biológica que forma el biofouling es amplia (bacterias, diatomeas, protozoos, esporas de algas, algas, hidroides, esponjas, poliquetos tubícolas, moluscos y crustáceos). El acúmulo de estos organismos individualmente pequeños llega a formar masas inmensas que alteran la operatividad de las estructuras en funcionamiento sobre las que se disponen (boyas, equipamiento sónar, interior y exterior de emisarios, oleoductos y gasoductos, estructuras piscifactoras o cascos de barcos), ocasionando severas pérdidas económicas. Se estima que una bioincrustación de seis meses de desarrollo en un barco provoca un aumento de peso de 150 kg/m2. El gasto de combustible aumenta hasta en un 40%, a lo que se deben sumar los costes derivados de la limpieza, pintura y pérdida de beneficios mientras el buque se encuentra fuera de funcionamiento. Para combatir la bioincrustación se han utilizado históricamente una gran variedad de sustancias naturales y artificiales aunque el TBT, desde su introducción en el mercado de la anti-incrustación en los años sesenta, ha sido el biocida más utilizado. Se trata de un compuesto artificial en el cual un átomo de estaño se une a tres cadenas butilo. Este catión tiene un alto poder fungicida, bactericida, alguicida e insecticida. Sin embargo, y debido a su elevada toxicidad el compuesto ocasiona graves efectos colaterales (toxicidad aguda y crónica en bivalvos a concentraciones 1 x 103 veces menores las de cualquier otro agente, reducción de poblaciones de poliquetos y anfípodos bentónicos, freno de crecimiento en mejillones, cambios en la composición faunística de comunidades bentónicas, desarrollo de imposex en gasterópodos, inmunosupresión en peces y mamíferos marinos). Las consecuencias biológicas del TBT se han dejado notar a nivel global, debido al uso tan extendido que se ha hecho de este. Asimismo, estos efectos son persistentes, pues degradación del compuesto ocurre de manera lenta, especialmente una vez se ha depositado (si bien permanece biodisponible) en el compartimento sedimentario. Sin embargo, a raíz de la implantación de las normas Dir 89/677/CEE, Dir 2002/62/CE y AFS 2001, se espera en un periodo de tiempo más o menos largo, los niveles ambientales del compuesto desciendan (en Europa y en un gran número de países aprobando la AFS 2001) y las alteraciones biológicas desaparezcan. OBJETIVOS, METODOLOGÍA Y PLAN DE TRABAJO: Los trabajos de investigación de la presente memoria se desarrollan, por un lado, en el campo de la ecotoxicología y, por otro, en el área de la biogeografía de invertebrados costeros; ambas cuestiones se ven fuertemente influenciadas por las actividades humanas en el medio marino. Para cada uno de las citadas aproximaciones se ha empleado una especie de gasterópodo de intermareal perteneciente al género Nassarius (Duméril), de distribución atlanto-mediterránea. Estas son, N. reticulatus (Linnaeus 1758), en el primero de los casos, y N. nitidus (Jeffreys 1867), en el segundo. Con respecto a la investigación ecotoxicológica, la primera parte del proyecto de tesis evalúa el estado de imposex y la bioacumulación de butilestánnicos en N. reticulatus en las costas del norte y noroeste de España bañadas por el Atlántico. Los distintos capítulos relacionados con este objetivo general buscan, de manera más específica: - Evaluar los niveles de contaminación por TBT actuales en la comunidad autónoma de Galicia a través de la cuantificación de los niveles bioacumulados del compuesto, así como a través del grado de alteración biológica (imposex) desarrollado. - También para esta región, discriminar entre alteraciones biológicas consecuencia de emisiones de TBT recientes e históricas, a través de la determinación de los niveles tisulares de mono-, di- y tributilestannano (MBT, DBT y TBT, respectivamente) y la evaluación de la importancia relativa relación de cada uno de ellos. - Realizar una caracterización espacial de la contaminación en función de la situación de las fuentes del contaminante y las características hidrográficas de las rías gallegas. - Analizar la evolución de la contaminación por TBT durante la última década en la Comunidad, mediante el análisis de los niveles tisulares del contaminante y de sus especies de degradación, así como de los cambios experimentados en el grado de imposex desarrollado en las poblaciones de N. reticulatus. - Para las costas bañadas por el Cantábrico, establecer una línea base (año 2006) en cuanto a las concentraciones tisulares de butilestánnicos y el nivel de desarrollo de imposex en la especie N. reticulatus a partir de la cual monitorizar su previsible descenso. - Evaluar la idoneidad de la especie como bioindicador de contaminación por TBT a bajas concentraciones ambientales del contaminante. - Buscar indicios acerca de la posible relación entre los niveles ambientales de TBT y ciertos procesos poblacionales observados muy recientemente de ciertas especies de moluscos, tales como el incremento de la densidad poblacional o la expansión del rango de distribución. La información que se maneja en la presente sección procede de cuatro campañas de muestreo realizadas en los años 1998, 2000, 2005 y 2008. En cada campaña, durante los meses de actividad sexual, se recogió un número superior a 30 N. reticulatus adultos en cada una de las muestras. La red de muestreo diseñada refleja los distintos aportes existentes del contamiante, incluyendo puntos en el área de influencia de grandes puertos mercantiles y/o pesqueros, lugares afectados por las emisiones procedentes de puertos menores, pesqueros o de ocupación náutico-deportiva, y localidades en costa abierta alejadas de los focos de emisión. La evaluación del grado de imposex se realizó según el protocolo habitual, de depuración, narcotización, estudio de tamaño poblacional, proporción de sexos, porcentaje de parasitación y cuantificación del desarrollo de imposex a través de los índices del Porcentaje de Incidencia (%I), de la Secuencia del Vaso Deferente (VDSI), de la Longitud Relativa de Pene (RPLI), del grado medio de convolución del Oviducto (AOS) y el Porcentaje de Hembras Estériles (%Fest). Se puede encontrar una guía detallada en Barreiro et al 2001 y OSPAR 2008. La determinación de butilestánnicos a partir de los tejidos blandos (para cada sexo por separado) se realizó siguiendo un proceso ciego según el procedimiento de Rodríguez-González et al (2004). La segunda parte del proyecto de tesis está relacionada con la genética poblacional y filogeografía de la especie N. nitidus en distribución a lo largo del Atlántico y del Mediterráneo: - Evaluar estructura poblacional de la especie mediante la señal proporcionada por un gen mitocondrial (citocromo c oxidasa, subunidad I; COI). - Explorar la historia demográfica reciente de la especie. - Comparar la demografía histórica de N. nitidus con la del congénere N. reticulatus. - Explorar una posible relación entre las preferencias de hábitat de N. nitidus y su demografía histórica. - Rastrear, mediante el uso de marcadores nucleares (Análisis de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados, AFLP) las evidencias de una migración de N. nitidus a través de la barrera biogeográfica que constituye el EG-AOF mediada por el ser humano. Para los análisis de esta sección se recogieron muestras en 15 poblaciones atlanto-mediterráneas de N. nitidus y de 6 asentamientos atlánticos de N. reticulatus. Para la obtención de la información genética, y según el enfoque del experimento, se llevó a cabo una secuenciación de genes mitocondriales o se produjeron perfiles de bandas AFLP. Los métodos empleados para la interpretación de esta señal, a grandes rasgos, consistieron en la evaluación de diversidades genéticas, análisis de redes genealógicas, determinación de estructura entre grupos genéticos, testado de aislamiento por distancia, estudios de neutralidad, análisis Bayesiano y métodos de asignación (existe un extenso número de referencias bibliográficas relacionadas con este apartado, las cuales es imposible resumir; para detalles en cuanto a métodos de esta sección se recomienda leer los apartados que detallan el material y los métodos en la presente memoria).