Aspectos funcionales de una proteína de membrana externa de la bacteria Acinetobacter baumannii

Resumo

Existe un incremento de infecciones nosocomiales (bacteriemias, neumonías, endocarditis, etc... ) provocadas por A.baumannii. El A..baumannii es un microorganismo gramnegativo, no fermentador, tradicionalmente considerado de baja virulencia (oportunista) que en la actualidad ha sido incluido como una de las bacterias más peligrosas segun la ISDA. Los méritos para estar incluido en esta lista son: su alta capacidad para adquirir genes de resistencia a antibióticos, su tasa de mortalidad entre 20 al 50% de las neumonías adquiridas en el hospital, la falta de tratamiento adecuado para tratar cepas multirresistentes, dificultad para erradicarlo de los hospitales dada su capacidad para soportar ambientes secos y limpios y su adaptación ante condiciones variables y presión selectiva. Uno de los factores que contribuye a la capacidad infectiva del A.baumannii es la citotoxicidad. OmpA del A.baumannii ha sido relacionada con la producción de apoptosis en células epiteliales (Hep-2) contribuyendo de manera significativa en la patogénesis de la bacteria. Entre Octubre del 2001 y Agosto del 2002, 30 pacientes fueron ingresados en el CHUAC. Dichos pacientes fueron infectados/colonizados por un clon de A.baumannii multirresistente (AbMR) incluyendo antibióticos carbapenemicos (se demostró la clonalidad del brote mediante técnica de tipación molecular: REP-PCR). Se realizó estudio de casos y controles para estudiar los factores de riesgo de adquisición de la cepa epidémica. Dos fueron las variables que presentaron significación tras realizar análisis de regresión logística: Presencia de cateterismo arterial (OR 1.13) y administración de imipenem (OR 11.128). Mediante seguimiento prospectivo se analizaron los factores pronósticos para el desarrollo de mortalidad destacando la presencia de hipotensión o shock (OR 24.63) como principal factor pronóstico. Se determina la base molecular de la resistencia a carbapenémicos en la cepa epidémica, descartando la presencia de ß-lactamasas o sistemas de bombas expulsión. Se centraron en el estudio de proteínas de membrana externa (OMP) y encontraron una Omp33-36 Kda implicada en la resistencia a carbapenems en nuestra cepa. Clonaron el gen codificante para la proteína Omp33-36 Kda y demostraron su implicación en la resistencia a carbapenems en su modelo mediante estudios de clonación molecular. Por otro lado, observaron que existía una rápida regulación en la síntesis/regresión de esta proteína de membrana externa. Caracterizaron la Omp33-36 como aquaporina a traves de ensayos en células eucarioticas (oocitos de Xenopus) y confirmaron su papel en el transporte de imipenem. Para poder estudiar la funcionalidad de esta proteína, con la intención de determinar una posible función adicional en la fisiología bacteriana o interacción con el huésped, realizaron experimentos para obtener la proteína Omp33-36 purificada. La proteína Omp33-36 mostró una conformación dimérica (CG-SLS) y su ubicación en la membrana externa del A. baumannii. En relación con la virulencia del A.baumannii, se realizaron diferentes técnicas de detección de APOPTOSIS: 1) Microscopía óptica visible y de fluorescencia: Estudiaron la despolarización mitocondrial (JC-1), el estado del citoesqueleto con FTIC-phalloidin, alteraciones nucleares con DAPI, cambios en la membrana celular con exposición de fosfatidilserina a la que se una la anexina y fragmentación del DNA detectado a través de Ioduro de propidio. 2) Microscopía electrónica: Analizaron cambios morfológicos característicos de apoptosis como condensación de la cromatina y cuerpos apoptóticos. Encontraron la presencia de organelas de doble membrana (autofagosomas) y vesículas de contenido citoplasmático (autolisosomas) característicos de AUTOFAGIA. 3) Activación de caspasas 8 (vía receptor) y 9 (vía mitocondrial) en la línea celular utilizada. 4) Finalmente detectaron mediante inmunoblot marcadores de apoptosis (caspasas 8,9 y procaspasas 3,9) y marcadores de autofagia (atg 8 y 7). Hasta el momento, se desconoce la razón estructural por la cuál la Omp33-36 causa un proceso de autofagia y apoptosis concomitante. Dichos resultados ponen de manifiesto la estructura cuarternaria dimérica de dicha proteína. Las futuras líneas de investigación se centrarán, en el estudio estructural de esta proteína y su actividad de fusión a la membrana como ha sido demostrado por SipB. Que el A.baumannii haya evolucionado y se haya adaptado al ser humano mediante la expresión de la Omp33-36, la cuál esta implicada en el paso de antibióticos al interior celular, en el paso de agua, y en la generación de muerte celular en celular en células eucariotas, permanece por aclarar.