Nuevas estrategias de compactación y transfección de dna/rna en terapia génica

Resumen

La Terapia Génica pretende tratar enfermedades hereditarias o adquiridas, a nivel molecular, bien reparando posibles daños del DNA celular, mediante la inserción de plásmidos de DNA (pDNA) en el citoplasma de las células dañadas, o bloqueando (silenciando) la función patogénica de algún gen mediante la inserción de RNAs pequeños de interferencia (siRNA). Entre los distintos métodos para transfectar ácidos nucleicos al interior celular, los sistemas autoagregados coloidales, como los lípidos catiónicos o aniónicos, ciclos supramoleculares (calixarenos o pilararenos) o las ciclodextrinas polianfifílicas, se han revelado como una alternativa plausible a los vectores víricos. Sin embargo, a pesar de todo lo que ya se conoce de este proceso, quedan todavía ciertos problemas por resolver, como los bajos niveles de transfección celular y la relativamente alta citotoxicidad. Además, se sabe poco acerca del proceso de liberación del ácido nucleico una vez el vector ha traspasado la membrana plasmática. Por ello esta Tesis Doctoral pretende minimizar los aspectos negativos del estos sistemas no virales y, en la medida de lo posible, buscar nuevas alternativas. Se plantean para ello tres grandes objetivos: Búsqueda de nuevos vectores génicos no virales, capaces de transfectar pDNAs al interior de distintos tipos de células, con mejores prestaciones que los actuales vectores de tipo no viral y que los vectores virales. Este objetivo, se focaliza en el diseño, síntesis, y caracterización de distintos tipos de moléculas con estructuras muy variadas. Búsqueda de nuevos agentes terapéuticos. Esta línea se basa en la compactación e internalización de siRNAs, con el objetivo no de reemplazar secuencias defectuosas de DNA, sino de bloquear ciertos genes responsables de alguna enfermedad. Es lo que se conoce como silenciamiento génico. Estudio del proceso de internalización celular y liberación del agente terapéutico. Objetivo que se centra en entender cómo atraviesa la membrana plasmática y qué barreras fisiológicas se encuentra el vector al entrar en contacto con los fluidos biológicos, aspecto de crucial importancia para los estudios in vivo, y, finalmente, en los ensayos clínicos. Cualquiera de los planteamientos anteriores se asienta en un triple enfoque que abarca: i) síntesis de vectores; ii) caracterización biofísica de los complejos que estos vectores forman con el ácido nucleico; y iii) evaluación bioquímica de los complejos previamente caracterizados. En la caracterización biofísica, se han utilizado técnicas experimentales de alta precisión, tales como movilidad electroforética-potencial zeta, electroforesis en gel de agarosa, anisotropía de fluorescencia, dispersión de rayos-X a bajo ángulo (SAXS), dispersión de luz dinámica (DLS) y microscopía de transmisión electrónica (crio-TEM). Una vez caracterizados los complejos, se ha evaluado su potencial para transfectar células de forma eficaz y segura. Para este fin, se ha recurrido a técnicas habituales en este campo, como citometría de flujo (FACS), luminometría, ensayos de protección frente a DNAsas, y ensayos de viabilidad celular. Por último, para lograr entender los mecanismos de internalización celular así como la influencia de la interacción del sistema vehiculizador con los fluidos biológicos en el proceso de transfección del ácido nucleico, se han utilizado la microscopía confocal de fluorescencia (CFM) y una técnica clave en investigación proteómica, NanoLC-MS-MS. Es de esperar que la aproximación multidisciplinar planteada en esta Tesis Doctoral ayude a tener un conocimiento más detallado y profundo de los mecanismos de transfección celular de ácidos nucleicos y, en consecuencia, a mejorar las prestaciones de los actuales vectores génicos in vitro, y, si es posible, in vivo. La consecución de esta Tesis Doctoral puede contribuir a desarrollar nuevos y mejorados protocolos de terapia génica en el tratamiento de diferentes enfermedades tanto hereditarias como adquiridas.