Enrichment and characterization of anaerobic bacteria degrading organohalide compounds

Resumo

La frecuente contaminación de las aguas subterráneas por compuestos organohalogenados es un grave problema ambiental debido a los riesgos ecológicos y para la salud humana de ella derivados. La bioremediación es una tecnología sostenible que evita algunos inconvenientes que presentan los tratamientos físico-químicos. En este estudio nos proponemos obtener y caracterizar cultivos que contengan bacterias anaerobias que degraden compuestos organohalogenados ambientalmente peligrosos, con potencial para la bioremediación in situ de aguas subterráneas. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, se obtuvo un cultivo enriquecido en bacterias del género Dehalogenimonas procedente de sedimentos del estuario del río Besós (Barcelona) que degrada alcanos con halógenos situados en carbonos adyacentes. En esta tesis se ha identificado la dehalogenasa reductora (RDasa) de esta cepa de Dehalogenimonas implicada en la conversión del dibromuro de etileno (EDB) al compuesto inocuo eteno, combinando técnicas de proteómica basadas en geles de electroforesis, ensayos enzimáticos específicos y nano-cromatografía líquida de alta resolución (nLC-MS/MS). La detección de esta enzima mediante nLC-MS/MS se ha conseguido relacionar con la producción de eteno en los ensayos enzimáticos específicos realizados con fragmentos de geles nativos de electroforesis correspondientes a los pesos moleculares caracerísticos de una dehalogenasa reductora. Esta RDasa es designada EdbA, y constituye la primera RDasa identificada en este género bacteriano que cataliza una reacción de debromación. Además, en el borrador del genoma de esta cepa no se ha detectado una subunidad B de anclaje a la membrana codificada de forma adyacente. Por tanto, EdbA podría ser la primera RDasa en ser demostrada funcional que no forma un operón con una subunidad RdhB. La identificación funcional de esta dehalogenasa reductora permite el diseño de primers específicos para evaluar el potencial o la actividad dihaloeliminadora de una potencial población de Dehalogenimonas durante una bioremediación in situ mediante la aplicación de técnicas como la PCR o la qPCR. Adicionalmente, se ha detectado una única RDasa en cultivos de esta cepa de Dehalogenimonas que transforman 1,2,3-tricloropropano a cloruro de alilo mediante dihaloeliminación combinando técnicas de ultracentrifugación, geles de electroforesis y nLC-MS/MS. Esta enzima detectada es ortóloga a DcpA, la responsable de la degradación de 1,2-dicloropropano a propeno, y ha sido detectada en la fracción proteica de membrana, lo cual concuerda con las predicciones realizadas mediante herramientas bioinformáticas sobre su localización subcelular. El mecanismo por el cual EdbA y esta ortóloga de DcpA se anclan a la membrana citoplasmática es desconocido, atribuyéndose a proteínas todavía no descritas. En este trabajo se ha obtenido un segundo consorcio bacteriano estable a partir de lodos de una planta de tratamiento de aguas residuales industriales aplicando técnicas de cultivo de enriquecimiento y dilución hasta la extinción. Este cultivo fermenta diclorometano (DCM) y dibromometano (DBM) a acetato y formato. Se ha demostrado que la bacteria responsable de la fermentación pertenece al género Dehalobacterium, y se ha procedido a su aislamiento. Sin embargo, las interacciones sinérgicas existentes entre las especies del consorcio han impedido obtener un cultivo puro. Seleccionando colonias en medio de cultivo semisólido, y aplicando antibióticos y cambios en la composición del medio, se ha obtenido una abundancia relativa de Dehalobacterium del 67 %. Le acompañan bacterias de los géneros Acetobacterium y Desulfovibrio, tal y como fue detectado mediante análisis de genotecas. El fraccionamiento isotópico del carbono durante la fermentación del DCM por este cultivo fue determinado mediante análisis de isótopos estables de compuestos específicos (CSIA). El valor obtenido, -27 ± 2 ‰, difiere del publicado previamente para una cepa de Dehalobacter que también fermenta el DCM (-15.5 ± 1.5‰). Estos valores son significativamente diferentes de los obtenidos con bacterias metilotróficas degradadoras de DCM (-45 a -61 ‰), y podrían permitir diferenciar vías de degradación de DCM en trabajos de bioremediación in situ. Finalmente, se ha demostrado que la presencia de co-contaminantes que se detectan de manera frecuente en acuíferos contaminados con DCM, como el tricloroetileno (TCE), 1,2-dicloroetano (1,2-DCA), cis-dicloroetileno (cis-DCE), 1,1,2-tricloroetano (1,1,2-TCA), ácido perfluorooctanoico (PFOA) y 3,4-dicloroanilina (3,4-DCA) no provocan una inhibición significativa en la degradación de DCM por parte del cultivo de Dehalobacterium, a las concentraciones estudiadas. De manera diferente, el cultivo presenta una resistencia dependiente de la dosis frente a los co-contaminantes cloroformo, sulfonato de perfluoroctano (PFOS) y diuron. Una concentración de cloroformo de 100 mg/L provoca una inhibición total. De manera similar, 200 mg/L de sulfonato de perfluoroctano (PFOS), y ≥ 25 mg/L de diuron provocan una inhibición severa, impidiendo la degradación completa del DCM. Sin embargo, en tratamientos con dosis más bajas de estos co-contaminantes no se ha observado efecto inhibidor. Para investigar la recuperación funcional de la degradación del DCM por parte de Dehalobacterium sp., aquellos cultivos afectados por la exposición a concentraciones inhibidoras de co-contaminantes son transferidos a medio fresco libre de co-contaminantes. En todos los casos, la actividad degradadora de DCM fue recuperada mostrando la destacable resiliencia de este cultivo fermentador de DCM que contiene bacterias del género Dehalobacterium, en términos de resistencia y capacidad de recuperación funcional. Los resultados derivados de este trabajo son de gran interés para evaluar el potencial de este cultivo para llevar a cabo una bioremediación in situ.