Análisis de los patrones de variación genética de las poblaciones de Giardia que parasitan humanos en el Área Sanitaria de Santiago de Compostela (Galicia)

Resumo

G. duodenalis (sin. G. intestinalis, G. lamblia) es un protozoo flagelado, binucleado y de vida parasitaria que infecta el epitelio gastrointestinal de humanos y otros mamíferos salvajes, de interés ganadero o domésticos. La manifestación clínica de la giardiasis es muy variable, desde la ausencia de síntomas hasta una diarrea aguda o crónica y no existe una terapia específica contra este parásito. Se asume que su reproducción es asexual, por división mitótica y segregación ecuatorial de los núcleos, aunque artículos recientes han propuesto la existencia de recombinación en la especie. La reproducción asexual explicaría que se hayan originado subtipos aislados dentro de la especie. Se conocen ocho “ensamblajes” diferentes (A-H) que algunos autores consideran especies distintas y de los cuales sólo dos, A y B, infectan a humanos, en concreto los subensamblajes AI, AII, BIII y BIV. La existencia de diferencias genéticas entre aislados abre la posibilidad de establecer asociaciones genotipo-patogenicidad, pero se necesita una descripción exhaustiva de la variabilidad genética de las poblaciones naturales que permita determinar los rangos de infección de cada grupo genético. En el análisis genético de este organismo existen una serie de limitaciones metodológicas a causa de la variabilidad existente en las muestras (infecciones mixtas o quistes heterocigotos), la existencia de dos núcleos diploides independientes en cada individuo y la posibilidad de que exista recombinación. La estrategia más común en el genotipado de muestras es la secuenciación directa por Sanger de uno o varios loci a partir de ADN extraído de muestra fecal. En los casos en que hay distintos alelos en una infección, esta estrategia produce dobles picos en las posiciones variantes, generando secuencias ambiguas. Para evitar que esto cause problemas en la interpretación de los resultados se usó un protocolo de amplificación por PCR seguido de clonación de los productos de PCR que permitió obtener secuencias aisladas y extraer los haplotipos presentes en cada muestra. A partir de estas secuencias se realizó una descripción detallada de la diversidad genética de los ensamblajes A y B. Los resultados obtenidos revelaron mayor diversidad en el ensamblaje B, lo que sugiere un tamaño efectivo de población inferior en el ensamblaje A. Las muestras del ensamblaje A pertenecen al subensamblaje AII, mientras que en el caso de B, los patrones de diversidad observados cuestionan la integridad filogenética de los subensamblajes BIII y BIV. Por otra parte, algunos aislados mostraron varios haplotipos distintos en cada locus, lo que fue interpretado como evidencia de la existencia de infecciones mixtas o heterocigosidad en los quistes. Para resolver esta cuestión se realizó un análisis de quistes individuales que permitió identificar el origen de la diversidad dentro de las muestras. Se aislaron quistes mediante micromanipulación y para cada uno de ellos se amplificaron siete loci en multiplex mediante PCR directa (sin necesidad de extracción de ADN). Aprovechando las posibilidades que ofrece la secuenciación masiva en paralelo en cuanto a la escalabilidad de los experimentos y la clonalidad de las lecturas generadas, se obtuvieron los haplotipos de cada locus y se generaron los genotipos multilocus de cada quiste. Los resultados obtenidos permitieron demostrar que la heterozigosidad es la principal causa de variación genética en las muestras de G. duodenalis. Esto sugiere que la propagación de las infecciones es clonal, ya que los aislados donde se detectó heterozigosidad todos los quistes mostraron el mismo genotipo multilocus. También se detectaron evidencias de recombinación entre muestras basándose en las diferentes combinaciones alélicas encontradas y la inconsistencia de las filogenias de los distintos loci. Por último, se encontraron quistes con un genotipo híbrido BIII/BIV en algunos loci, lo que sugiere que estos subensamblajes no se corresponden con unidades taxonómicas reales.