Oxifuncionalización selectiva de compuestos alifáticos por peroxigensas fúngicas

Resumo

La presente Tesis aborda el estudio de la oxifuncionalización enzimática de diferentes compuestos alifáticos lineales (ácidos grasos, alcoholes grasos y alcanos/alquenos) y cíclicos (esteroides y secosteroides), catalizada por diferentes peroxigenasas fúngicas (en presencia de H2O2 como co-sustrato) incluyendo las peroxigenasas salvajes de Agrocybe aegerita (AaeUPO) y Marasmius rotula (MroUPO) y la peroxigenasa recombinante de Coprinopsis cinerea (rCciUPO). La evaluación de la conversión de los distintos sustratos así como la identificación de los productos de reacción se llevó a cabo mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS) y en algunos casos Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Por otro lado, el mecanismo de reacción de dichas oxifuncionalizaciones enzimáticas se estudió utilizando H2 18O2 como cosustrato. Finalmente, con el objeto de investigar diferentes aspectos de las relaciones estructura-función de las peroxigenasas se realizaron estudios computacionales utilizando el programa PELE (Protein Energy Landscape Exploration). En términos generales, las peroxigenasas fúngicas AaeUPO y rCciUPO catalizaron la oxifuncionalización selectiva de los diferentes compuestos alifáticos lineales estudiados. Se observó que rCciUPO resultó ser más eficiente que AaeUPO hidroxilando los diferentes ácidos grasos (saturados e insaturados) ya que consiguió mayor grado de conversión de los sustratos (en las mismas condiciones de reacción) aunque con ambas enzimas se observó que dicho grado de conversión dependía de la longitud de la cadena del ácido graso. Por otro lado, ambas enzimas dieron lugar a los mismos productos de reacción que fueron principalmente derivados monohidroxilados (en las posiciones ɷ-1 y ɷ -2) de los ácidos grasos, tanto saturados como insaturados. Sin embargo, con el ácido miristoleico, se observó una estricta regioselectividad en las reacciones de ambas enzimas formándose exclusivamente el isómero monohidroxilado en la posición ɷ -2. Se estudiaron además, las reacciones de varios ésteres de ácidos grasos con las enzimas AaeUPO y rCciUPO observándose también la formación de derivados monohidroxilados en las posiciones ɷ -1 y ɷ -2. En cuanto a los alcoholes grasos, ambas enzimas fueron capaces de transformar estos compuestos en igual medida. Como productos principales de la reacción se obtuvieron los ácidos grasos correspondientes, así como derivados hidroxilados en las posiciones ɷ -1 y ɷ -2 de los alcoholes y de los ácidos. En las reacciones enzimáticas ealizadas con los alcanos se obtuvieron diferentes productos monohidroxilados en las posiciones ɷ -1 y ɷ -2, y dihidroxilados en las posiciones 2,( ɷ -1); 2,( ɷ -2) y 3, (ɷ -2). Se observó que la predominancia de los derivados mono- o dihidroxilados está relacionada con la concentración de acetona presente en el medio de reacción. Cabe mencionar que la obtención enzimática de dioles a partir de alcanos reviste gran interés industrial y se depositó una patente internacional (WO 2013/004639 A2) que se ha incluido en la Tesis. Por otro lado, también se estudió la oxifuncionalización selectiva de diferentes compuestos esteroidales (esteroles libres y esterificados, y cetonas e hidrocarburos esteroidales) por las peroxigenasas rCciUPO, AaeUPO y MroUPO. En general se observó una mayor reactividad de la rCciUPO (seguida de AaeUPO) que de la MroUPO frente la mayoría de estos compuestos esteroidales, excepto con el pregnano (que sólo fue hidroxilado por la MroUPO). La hidroxilación catalizada por estas peroxigenasas tuvo lugar en la cadena lateral (principalmente en la posición C-25) en la mayoría de los compuestos estudiados. Sólo se observó hidroxilación en el anillo (además de en la cadena lateral) en los compuestos esteroidales con dobles enlaces conjugados en C-3 y C-5 (además de en el pregnano). En esta Tesis se ha demostrado la hidroxilación regioselectiva de la vitamina D (vitamina D3 y D2) por las peroxigenasas rCciUPO y AaeUPO, en la posición C-25. La hidroxilación de estos secosteroides reviste gran interés industrial ya que además de que la reacción trascurre con una alta regioselectividad en todos los casos (100% con rCciUPO) la 25-hidroxitamina D se considera mejor agente terapéutico para diferentes enfermedades que la propia vitamina D y también tiene aplicación en alimentación animal. Con el fin de estudiar el mecanismo de la oxifuncionalización enzimática de los diferentes compuestos alifáticos mencionados, se llevaron a cabo reacciones de los mismos en presencia de H2 18O2, y se observó que el átomo de oxígeno introducido por las enzimas en los diferentes sustratos proviene del H2O2 (y no del O2) demostrándose la actividad peroxigenasa de las enzimas en estas reacciones de hidroxilación. Finalmente, un enfoque combinado mediante estudios experimentales y computacionales permitió demostrar que no existe un único factor que determine el perfil de hidroxilación del sustrato por la enzima, sino que es el resultado de la suma de muchos factores estructurales, tanto sobre la molécula del sustrato como del sitio activo de la enzima. En el caso particular de los esteroides (que fueron los compuestos estudiados en mayor profundidad) estos factores incluyen el carácter polar/apolar de los grupos sustituyentes en las posiciones C-3/C-7 del anillo, la presencia/ausencia de dobles enlaces en el anillo esteroidal, y la longitud y características de la cadena lateral que afectan a la entrada del sustrato en el sitio activo de la enzima por C-25. En conclusión, las peroxigenasas estudiadas en esta Tesis (rCciUPO, AaeUPO y MroUPO) representan una alternativa sostenible a la síntesis química ya que catalizan la oxifuncionalización selectiva de diferentes compuestos alifáticos (tanto lineales como cíclicos) de interés en la industria química y farmacéutica, en presencia de H2O2 como único co-sustrato.