Evolución dirigida de lacasas fúngicastermoestabilidad y síntesis de colorantes heteropolímericos

Resumo

Las lacasas son oxidasas multicobre capaces de oxidar principalmente fenoles, polifenoles y aminas aromáticas. Estas enzimas tan sólo requieren O2 como co-sustrato liberando H2O como único subproducto, lo que las convierte en uno de los biocatalizadores verdes más prometedores. Su centro catalítico está formado el cobre del sitio T1, donde los sustratos reductores son oxidados, y los tres cobres del clúster trinuclear donde el oxígeno molecular y es reducido a dos moléculas de agua. En especial, las lacasas fúngicas presentan una gran relevancia industrial debido a su mayor potencial redox en el sitio T1, lo que facilita su aplicación en muchos sectores biotecnológicos. Sin embargo, estas enzimas deben ser modificadas para alcanzar los estándares industriales. En la presente Tesis Doctoral se ha abordado la evolución dirigida de dos lacasas fúngicas para: i) mejorar la termoestabilidad y ii) promover la síntesis de colorantes heteropoliméricos C-N. Evolución para la mejora de la termoestabilidad Dado que la termoestabilidad es un parámetro esencial para muchas aplicaciones industriales, la variante termoestable OB-1, proveniente de la lacasa del hongo PM1, fue objeto de evolución enfocada para la mejora de su termoestabilidad. Para ello se identificaron segmentos de alta flexibilidad en la superficie de la enzima mediante algoritmos computacionales (análisis de B-factor y dinámica molecular), los cuales fueron posteriormente fortalecidos mediante herramientas de evolución enfocada, como MORPHING, mutagénesis saturada y mutagénesis combinatorial saturada. Tras la creación de librerías en Saccharomyces cerevisiae, las variantes mejoradas fueron seleccionadas mediante ensayos de exploración high-throughput para termoestabilidad. Tras dos generaciones se obtuvo el mutante K-2SO, el cual presentó varias mutaciones en loops flexibles que aumentaron notablemente la termoestabilidad. K-2SO fue caracterizado bioquímicamente junto con otras variantes obtenidas a lo largo del proceso evolutivo, permitiendo el desglose de las propiedades evolucionadas. Particularmente, K-2SO mostró un incremento en su temperatura óptima y un notable aumento (~6 veces) en su vida media con respecto al parental, sin comprometer su eficiencia catalítica. Síntesis de colorantes heteropoliméricos C-N La producción enzimática de colorantes heteropoliméricos a pH básico es un proceso de gran interés en la industria textil. Para ello se diseñó una lacasa fúngica mediante evolución dirigida, de forma que fuera capaz de trabajar a pH alcalino en la síntesis de un colorante heteropolimérico C-N formado por catecol y ácido 2,5-diaminobencenosulfónico (2,5-DABSA). En primer lugar, se compararon varias lacasas fúngicas (provenientes de campañas evolutivas previas) para la síntesis del heteropolímero C-N a pH 8, seleccionando una variante alcalina de la lacasa de Myceliophthora thermophila como punto de partida para la posterior evolución. Las librerías de mutantes fueron construidas y expresadas en S. cerevisiae, y el cribado high-throughput se llevó a cabo utilizando un ensayo colorimétrico para la detección del heteropolímero C-N. La combinación de técnicas clásicas y enfocadas de evolución dio como resultado una nueva variante de lacasa alcalina con unos elevados niveles de secreción ( 37 mg/L) y una eficiencia catalítica para la oxidación a pH 8 3,5 veces mejor con respecto a la lacasa de M. thermophila nativa, favoreciendo la síntesis de heteropolímeros C-N a pH básico. Mientras que la mejora de la expresión fue principalmente el resultado de la acumulación de mutaciones que favorecieron el uso de codones en levadura junto con la recuperación de una mutación de secreción, el incremento en la actividad para la síntesis del colorante heteropolimérico C-N fue dependiente de las mutaciones alcalinas heredadas. De este modo, esta lacasa alcalina evolucionada y con elevada secreción podría ser una plataforma de alto valor para la síntesis orgánica a pHs básicos.